張明杰，李宗澤，徐楊，梁迅

（錦州醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000）

小鼠CD45-/CD31+肺側(cè)群細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究*

張明杰，李宗澤，徐楊，梁迅

（錦州醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000）

目的探討在體外誘導(dǎo)分化肺側(cè)群細(xì)胞（SP）的特性。方法 取小鼠肺組織，流式細(xì)胞術(shù)分選小鼠白細(xì)胞分化抗原（CD）45-/CD31+肺SP；免疫熒光檢測分選肺SP三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ABCG2）的表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測肺SP中ABCG2、酪氨酸激酶2（Tie2）及血管性血友病因子（vWF）的表達(dá)。細(xì)胞體外分化誘導(dǎo)14d后，免疫熒光檢測細(xì)胞vWF的表達(dá)；RT-PCR檢測分化誘導(dǎo)前后細(xì)胞中ABCG2和vWF的表達(dá)。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)成功分選出CD45-/CD31+肺SP細(xì)胞，免疫熒光檢測其表達(dá)ABCG2；RT-PCR檢測SP表達(dá)ABCG2和Tie2，不表達(dá)vWF。主群細(xì)胞表達(dá)vWF；分化誘導(dǎo)前的肺SP表達(dá)ABCG2；分化誘導(dǎo)后的肺SP表達(dá)vWF。結(jié)論 CD45-/CD31+肺SP是血管內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，具有干細(xì)胞分化特性。在體外培養(yǎng)可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。

側(cè)群細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2

肺疾病是引起死亡的主要原因[1-3]。肺移植并不是5年死亡率＜50%的萬靈藥[4]，因此迫切需要新方法。側(cè)群細(xì)胞（side population cells，SP）是利用Hoechst染料和流式細(xì)胞儀進(jìn)行造血干細(xì)胞分離時(shí)發(fā)現(xiàn)的特殊細(xì)胞。白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）45+為血液細(xì)胞標(biāo)記，CD45-為肺細(xì)胞標(biāo)記，CD31+為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記，CD31-為間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記。以往的研究對CD45+和CD31-已做報(bào)道，但未報(bào)道CD45-/CD31+[5-7]。本實(shí)驗(yàn)收集小鼠肺，流式細(xì)胞術(shù)分選出CD45-/CD31+側(cè)群細(xì)胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，探討其是內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，可以在體外發(fā)育成內(nèi)皮細(xì)胞，為臨床治療肺疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 內(nèi)皮培養(yǎng)基（endothelial cell growth medium-2，EGM-2），購自美國 Cambrex公司，Methocult GF M3534購自加拿大STEMCELL Technologies公司，Tryspin購自美國Sigma公司，膠原酶、分散酶購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）試劑盒購自美國Promega公司，抗體購自英國Abcam公司，Hoechst33342、DAPI、胰蛋白酶、維拉帕米及碘化丙啶（propidium iodide，PI）儀購自美國Sigma公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳CO2孵箱購自美國Sheldon Manufacturing Inc公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，超凈工作臺購自新加坡ESCO公司，酶標(biāo)儀購自德國BMG公司，離心機(jī)購自德國Het-tich公司，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購自美國Thermo Scientifics公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)小鼠來自遼寧省錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 收集細(xì)胞 取小鼠肺組織用刀片攪碎，在37℃、0.1%膠原酶、2.4 u/ml分散酶和2.5 mmol CaCl2條件下孵育1 h，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate belanced solution，PBS）懸浮、過濾，收集細(xì)胞[8]。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分選CD45-/CD31+小鼠肺側(cè)群細(xì)胞及檢測 取收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1×106個(gè)/ml濃度，重懸細(xì)胞于培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)組加入終質(zhì)量濃度為5 mg/L的熒光染料Hoechst33342；對照組加入終質(zhì)量濃度為5 mg/L的熒光染料Hoechst 33342及終質(zhì)量濃度為100 mg/L的維拉帕米。37℃避光水浴90min，每隔20min輕微震蕩1次。90min后終止染色，用冷的PBS洗滌，4℃、1 000r/min離心5 min，去上清液，用冷的PBS重懸。加入終質(zhì)量濃度為 2 mg/L的 PI，上流式細(xì)胞儀分選，Hoechst33342的激發(fā)光為375 nm。流式細(xì)胞儀分別收集側(cè)群細(xì)胞與主群細(xì)胞。用CD44和干細(xì)胞抗原1 （stem cell antigen 1，Sca1）抗體檢測其表達(dá)情況[9]。

1.2.3 免疫熒光染色檢測三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）蛋白表達(dá) 將玻片放在流式細(xì)胞儀特定位置收集細(xì)胞。丙酮固定幾秒（-20℃），PBS漂洗3次，2 min/次。0.5%Txiton X-100處理20 min，PBS漂洗3次，2 min/次。血清封閉20 min，PBS漂洗3次，2 min/次。滴加一抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次，2min/次。滴加二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，2 min/次。加入4'，6-二脒基 -2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5min，PBS漂洗3次，2min/次。熒光顯微鏡觀察并拍照。

表1PCR引物序列

1.2.4 RT-PCR檢測ABCG2、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及酪氨酸激酶2（tyrosine kinase，Tie2）基因的表達(dá) 收集的細(xì)胞用冷的PBS漂洗2次，12 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入350 μl裂解緩沖液，充分裂解。加入1ml Trizol，冰上勻漿。轉(zhuǎn)入新的1.5 ml離心管，室溫保存5 min。加0.2 ml氯仿，震蕩混勻，室溫放置5 min。4℃、10 000 r/min離心15 min，將上層吸到一個(gè)新的1.5 ml離心管，按照試劑盒說明書提取RNA。按照試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。見表1。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測其是否為CD45-/CD31+小鼠肺側(cè)群細(xì)胞 用Methocult GF M3534 media培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)CD45-/CD31+小鼠肺側(cè)群細(xì)胞14 d，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 細(xì)胞體外分化誘導(dǎo)及免疫熒光檢測vWF表達(dá)和RT-PCR檢測ABCG2的表達(dá) 將流式細(xì)胞儀分選的細(xì)胞用EGM-2培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下，連續(xù)培養(yǎng)14 d。14 d后，取一部分培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測ABCG2的表達(dá)，再取一部分培養(yǎng)的細(xì)胞（14 d）和新分選的細(xì)胞（0 d）通過RT-PCR反應(yīng)檢測兩者ABCG2和vWF的表達(dá)，方法同1.2.4。通過Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，測其積分光密度值，以各條帶值與內(nèi)參條帶值之比為目的基因的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分選的CD45-/CD31+小鼠肺側(cè)群細(xì)胞

分離的收集的細(xì)胞經(jīng)過流式分選后，側(cè)群細(xì)胞位于左下角兩種熒光均很弱的區(qū)域。實(shí)驗(yàn)組低染區(qū)側(cè)群細(xì)胞比例為0.4%，對照組低染區(qū)側(cè)群細(xì)胞比例＜0.4%，被維拉帕米阻滯，證實(shí)從小鼠肺組織收集的細(xì)胞中確實(shí)存在側(cè)群細(xì)胞。進(jìn)一步分選出CD45-/CD31+肺側(cè)群細(xì)胞，所占比例為22%。CD分化群44及Sca1檢測結(jié)果呈現(xiàn)CD44陰性，Sca1陽性。見圖1。

2.2 ABCG2蛋白的表達(dá)

分選的CD45-/CD31+肺側(cè)群細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，觀察到細(xì)胞表達(dá)ABCG2蛋白。見圖2。

2.3 ABCG2、vWF及Tie2基因的表達(dá)

RT-PCR檢測基因表達(dá)，結(jié)果呈現(xiàn)肝臟特異性脂蛋白（liver specific lipoprotein，LSP） 高表達(dá)ABCG2，肺主群細(xì)胞（lung main population，LMP）不表達(dá)ABCG2。LSP表達(dá)的ABCG2相對含量與LMP比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=58.441，P= 0.000）。LMP高表達(dá)vWF，LSP不表達(dá)vWF，LSP表達(dá)的vWF相對含量與LMP比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-12.291，P=0.000）。Tie2在LSP與LMP中均表達(dá)，LSP表達(dá)的Tie2相對含量與LMP比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-95.905，P= 0.000）；Tie2是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記，提示LSP可能是內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞。見表2和圖3。

圖1 分選的小鼠CD45-/CD31+肺側(cè)群細(xì)胞

2.4 CD45-/CD31+小鼠肺側(cè)群細(xì)胞的檢測結(jié)果

分選的CD45-/CD31+肺側(cè)群細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果呈現(xiàn)LSP大量增殖并呈現(xiàn)聚集生長狀態(tài)，流式技術(shù)結(jié)果呈現(xiàn)Sca1陽性，其仍然是CD45-/CD31+小鼠肺側(cè)群細(xì)胞。見圖4、5。

2.5 vWF和ABCG2的表達(dá)

細(xì)胞體外分化誘導(dǎo)，免疫熒光檢測結(jié)果呈現(xiàn)有ABCG2的表達(dá)；RT-PCR檢測結(jié)果呈現(xiàn)誘導(dǎo)前的LSP表達(dá)ABCG2，誘導(dǎo)后的LSP不表達(dá)ABCG2，誘導(dǎo)前LSP表達(dá)的ABCG2相對含量與誘導(dǎo)后比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=62.682，P=0.000）。誘導(dǎo)后的LSP表達(dá)vWF，誘導(dǎo)前的LSP不表達(dá)vWF，誘導(dǎo)前的LSP表達(dá)的vWF相對含量與誘導(dǎo)后比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-19.503，P=0.000）；說明CD45-/CD31+小鼠肺側(cè)群細(xì)胞分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。見圖6、7和表3。

圖2ABCG2蛋白的表達(dá) （×40）

表2CD45-/CD31+肺SP與肺MP的ABCG2、vWF及Tie2相對表達(dá)量比較 （n=8，±s）

表2CD45-/CD31+肺SP與肺MP的ABCG2、vWF及Tie2相對表達(dá)量比較 （n=8，±s）

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圖3ABCG2、vWF及Tie2的表達(dá)

圖4 CD45-/CD31+小鼠肺側(cè)群細(xì)胞克隆形成

圖5 流式細(xì)胞儀檢測CD45-/CD31+

圖6vWF的表達(dá) （×40）

圖7ABCG2和vWF的表達(dá)

表3 誘導(dǎo)前后側(cè)群細(xì)胞ABCG2、vWF的相對表達(dá)量比較（n=8，±s）

表3 誘導(dǎo)前后側(cè)群細(xì)胞ABCG2、vWF的相對表達(dá)量比較（n=8，±s）

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3 討論

近年來，對側(cè)群細(xì)胞的研究和應(yīng)用都取得很大進(jìn)展，側(cè)群細(xì)胞由于分布廣泛，含量豐富，又有明確的表型標(biāo)記和分離純化方法，所以可以用于基因治療、生物醫(yī)學(xué)研究、生長發(fā)育過程研究等領(lǐng)域。側(cè)群細(xì)胞可以通過不對稱分裂產(chǎn)生大量與自己相同的子代細(xì)胞，同時(shí)也能分化成具有有限分化能力的后代。MOSERLE等[10]發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞株Hep3B、MHCC97-L、MHCC97-H及HCCLM3所含的側(cè)群細(xì)胞比例分別為0.9%、4.2%、14.5%和28.7%，所得高純度的側(cè)群細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，這4種細(xì)胞株始終能保持一定的側(cè)群細(xì)胞比例，說明側(cè)群細(xì)胞具有自我更新的功能，這有助于維持穩(wěn)定的細(xì)胞儲備。新的研究表明，側(cè)群細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)和維持人類腫瘤的多種類型[11]。側(cè)群細(xì)胞在動(dòng)物模型中能夠產(chǎn)生腫瘤，非側(cè)群細(xì)胞則不能[12]，從腫瘤干細(xì)胞中分離側(cè)群細(xì)胞，進(jìn)而研究側(cè)群細(xì)胞的特性[13]。側(cè)群細(xì)胞的克隆形成和侵襲能力明顯高于非側(cè)群細(xì)胞，該特征進(jìn)一步表明側(cè)群細(xì)胞的其他屬性[14]。同時(shí)，對肺側(cè)群細(xì)胞進(jìn)行研究，對肺損傷及肺部疾病的治療有非常重要的意義，對腫瘤的防治和干細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展有深遠(yuǎn)的影響[15]。

肺是呼吸系統(tǒng)的一部分，功能是進(jìn)行氣體交換，良好的肺功能是維持生命的保障。胸外科角度上肺是胸腔內(nèi)最大的臟器，也是胸外科中病變種類和發(fā)病數(shù)量最多的器官。常見的肺部疾病有氣胸、肺大泡、肺氣腫和肺癌，肺源性心臟病、呼吸衰竭、肺栓塞、肺膿腫、肺炎、新生兒肺炎、小兒肺炎、氣管炎、哮喘、肺結(jié)核、塵肺、間質(zhì)性肺疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等。肺部疾病比較常見，而且發(fā)起病來后果嚴(yán)重，甚至危及生命，例如慢性肺源性心臟病，是由于肺組織、肺動(dòng)脈的原發(fā)性病變，使肺血管阻力增加，肺動(dòng)脈壓力升高，從而造成右心負(fù)荷加重，右心室肥大，最終導(dǎo)致右心功能衰竭，繼而危及生命[16]。研究肺側(cè)群細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以為由于肺損傷及肺疾病等引起的細(xì)胞損傷提供新的細(xì)胞，從而延緩病情。

本實(shí)驗(yàn)分選小鼠CD45-/CD31+肺側(cè)群細(xì)胞，通過體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，最終分化發(fā)育為血管內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD45-/CD31+肺側(cè)群細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，具有干細(xì)胞分化特性。這為臨床干細(xì)胞的來源獲取提供新途徑，并且為干細(xì)胞的研究及肺部疾病的治療研究提供新的思路。

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（童穎丹 編輯）

Differentiation of mouse CD45-/CD31+lung side population cells into endothelial cellsin vitro*

Ming-jie Zhang,Zong-ze Li,Yang Xu,Xun Liang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Jinzhou Medical University, Jinzhou,Liaoning 121000,China)

ObjectiveTo investigate the characteristics of differentiation of lung side population(LSP)cells in vitro.Methods Mouse lung tissue was taken,and mouse CD45-/CD31+LSP cells were sorted by flow cytometry.Immunofluorescence was used to detect the expression of ATP-binding cassette sub-family G member 2 (ABCG2)in the isolated LSP cells.RT-PCR was applied to detect the expression ofABCG2,Tie2andvWF in mouse CD45-/CD31+LSP cells.After the LSP cells were cultured for 14 days,the expression ofvWFwas detected by immunofluorescence,and the mRNA expression ofABCG2as well asvWFof both freshly isolated LSP cells and cultured LSP cells were examined by RT-PCR.Results Flow cytometry sorted out the CD45-/CD31+LSP cells,and immunofluorescence tested that they expressedABCG2.RT-PCR results revealed that LSP cells expressedABCG2as well asSMAandTie2,but did not expressvWF.LMP highly expressed vWF.The CD45-/CD31+LSP cells expressedABCG2,but did not expressvWFbefore induction of differentiation;while the cells expressedvWFin stead ofABCG2after the induction of differentiation.Conclusions CD45-/CD31+LSP cells might be the progenitor cells of vascular endothelial cells,which possess the characteristics of stem cell differentiation,and can be differentiated into vascular endothelial cellsin vitro.

side population cell;endothelial cell;ATP-binding cassette sub-family G member 2

R329.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.004

1005-8982（2017）06-0017-06

2016-08-25

國家自然科學(xué)基金（No：81370619）

梁迅，E-mail：1161653758@qq.com