于建超，王江平，李應(yīng)龍，錢彪，倪釗，王新敏，李強，王勤章

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，新疆 石河子 832000）

人干細胞白血病基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其在Cajal樣間質(zhì)細胞中的表達*

于建超，王江平，李應(yīng)龍，錢彪，倪釗，王新敏，李強，王勤章

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，新疆 石河子 832000）

目的構(gòu)建含人干細胞白血?。⊿CL）基因的重組慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的Cajal樣間質(zhì)細胞（ICC），為進一步利用慢病毒表達載體行體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。方法 通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）將人SCL基質(zhì)粒內(nèi)的遺傳物質(zhì)擴增，與慢病毒載體質(zhì)粒GV287-EGFP結(jié)合，構(gòu)建重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL，通過Western blot檢測及基因測序?qū)﹃栃钥寺∵M行鑒定，并測定病毒滴度。體外分離、培養(yǎng)及鑒定ICC，重組慢病毒載體以感染復(fù)數(shù)（MOI）值為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0時，分別轉(zhuǎn)染ICC，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，計算不同MOI值的轉(zhuǎn)染效果，確定最佳MOI值。重組慢病毒載體以最佳MOI值感染ICC作為實驗組，以空載體轉(zhuǎn)染的ICC（空載體組）及未轉(zhuǎn)染的ICC（空白組）作為對照，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測SCL基因在ICC中的表達。結(jié)果 經(jīng)Western blot檢測及基因測序鑒定SCL重組慢病毒表達載體構(gòu)建成功，并成功轉(zhuǎn)染ICC，激光共聚焦顯微鏡下可觀察到強綠色熒光。MOI為10時轉(zhuǎn)染效果最佳，轉(zhuǎn)染效率＞85%；RT-PCR結(jié)果表明，實驗組SCL基因的表達量高于空載體組和空白組。結(jié)論 成功制備人SCL基因重組慢病毒載體，并能高效轉(zhuǎn)染ICC，介導(dǎo)SCL基因在ICC中表達。

干細胞白血病基因；慢病毒載體；轉(zhuǎn)染；Cajal樣間質(zhì)細胞

糖尿病膀胱異常病癥（diabetic cystopathy，DCP）屬于糖尿病末期出現(xiàn)頻率最高的并發(fā)癥，其在糖尿病患者中的發(fā)病率可達19%～84%[1-2]，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，其病因復(fù)雜，截止目前尚未完全闡明糖尿病膀胱異常病癥的發(fā)病機制[3-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在人類、豚鼠等很多動物的膀胱逼尿肌中存在著一種與胃腸道Cajal樣間質(zhì)細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）形態(tài)類似的特殊細胞，稱為膀胱ICC[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DCP膀胱中，ICC數(shù)量明顯減少，與其他ICC、逼尿肌細胞及神經(jīng)末梢之間的縫隙連接均顯著減少，并伴隨細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的改變；體外模擬高糖環(huán)境培養(yǎng)豚鼠膀胱ICC發(fā)現(xiàn)，該細胞不僅發(fā)生形態(tài)改變，而且細胞自發(fā)興奮功能下降[8]。上述研究結(jié)果表明，高糖環(huán)境所導(dǎo)致的膀胱ICC數(shù)量減少、起搏功能降低是DCP的發(fā)病機制之一。高糖環(huán)境引起c-kitmRNA和c-kit蛋白表達下降是導(dǎo)致ICC數(shù)量減少，形態(tài)和功能損害的主要原因。因此如果能恢復(fù)和增強高糖環(huán)境下受損的c-kit表達，則有可能促進膀胱ICC增殖，重塑高糖環(huán)境下受損的ICC表型，恢復(fù)ICC形態(tài)和起搏功能，促進膀胱功能恢復(fù)，從而達到治療DCP的目的。

研究證實，c-kit基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在干細胞白血病基因（stem cell leukemia，SCL）結(jié)合位點，SCL主要是通過作用于c-kit基因啟動子，調(diào)節(jié)c-kit表達來發(fā)揮其“生存基因”的功能，而SCL過表達則可使c-kit表達升高，并對干細胞因子（stem cell factor，SCF）反應(yīng)性恢復(fù)正常[9]，可見SCL在c-kit的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，通過過表達SCL基因，上調(diào)c-kit表達來逆轉(zhuǎn)?；蛑委熓窃贒NA或RNA水平上人為地將某些外源性的基因?qū)胂鄳?yīng)的靶細胞，從而獲得表達，繼而產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)以達到治療的目的。本實驗通過構(gòu)建SCL基因過表達慢病毒載體，轉(zhuǎn)染ICC，通過導(dǎo)入外源性SCL基因可以實現(xiàn)對ICC細胞c-kit表達的上調(diào)，促進ICC表型恢復(fù)，具有抑制和逆轉(zhuǎn)ICC損害，治療糖尿病膀胱異常病癥的可能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年豚鼠4只，雌雄不限，體重250～400 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

慢病毒載體及包裝系統(tǒng)（含GV287-EGFP表達載體、p-Helper 1.0和p-Helper 2.0 3個質(zhì)粒）購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，感受態(tài)大腸桿菌DH5α、293T細胞與載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）胎牛血清轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA片段提純試劑盒與DNA提取試劑盒購自日本Qlagen生物研究中心，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自立陶宛Fermen tas公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium do decyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀購自南京天能生物研究公司。

1.3 人SCL基因重組慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及測序

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增人SCL基因，引物由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。正向引物：5-GAGGATCCCCGG GTACCGGTCGCCACCATGACCGAGCGGCCGCCGA G-3；反向引物：5-TCACCATGGTGGCGACCGGCCG AGGGCCGGCTCCATC-3。反應(yīng)條件：94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。將含人SCL基因的PCR擴增因子進行提純，通過In-Fusion轉(zhuǎn)換酶的催化可以把靶基因的PCR產(chǎn)物與GV287-EGFP線性化載體進行結(jié)合。提取含有人SCL基因GV287-EGFP質(zhì)粒陽性克隆菌落PCR模板上的交換轉(zhuǎn)化產(chǎn)物長出菌，加入10μl培養(yǎng)基并混勻，用1μl設(shè)置模板，通過PCR反應(yīng)實現(xiàn)基因擴增，正向引物：5-GGTATAAGAGGCGCGACCAG-3；反向引物：5-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3。反應(yīng)條件：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸6 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，設(shè)陰性對照[雙蒸水（distillation-distillation H2O，ddH2O）]、陰性對照（空載自連對照）及陽性對照[甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）]，并對陽性克隆進行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.4 人SCL基因重組慢病毒載體的包裝及滴度測定

以293T細胞為包裝細胞，制備編碼慢病毒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，3種質(zhì)粒分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明書，共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染8 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集含人SCL基因慢病毒載體的細胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的含人SCL基因慢病毒載體濃縮液，用熒光法在293T細胞中測定病毒滴度。

1.5 豚鼠膀胱ICC體外培養(yǎng)及鑒定

1.5.1 體外分離、培養(yǎng)ICC 隨機選取實驗動物，用10%水合氯醛將其麻醉，無菌環(huán)境中剖開腹部獲得膀胱組織，剔除膀胱壁內(nèi)黏膜，將膀胱剪碎至1 mm3大小的碎塊，在1.0 mg/ml胰蛋白酶中，室溫下消化15 min，加入DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含1.0 mg/mlⅤ型膠原酶，青霉素100 u/ml，鏈霉素100 g/ml），37℃、5%二氧化碳CO2溫箱內(nèi)消化90 min。超凈臺下將消化好的絮狀液進行無菌過濾，1 500 r/min，離心5 min。過濾上清液并丟棄，然后用1%磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）液進行漂洗、反復(fù)離心，共3次。充分吹打單細胞懸浮液后進行接種處理，將其接種至6孔培養(yǎng)皿中，加入內(nèi)含10%胎牛血清液，1%雙抗（青霉素100 u/ml鏈霉素100 g/ml）的低糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5.2 ICC的鑒定 細胞接種24 h后，可以看到ICC大部分貼壁生長，但平滑肌細胞未發(fā)生該現(xiàn)象，因此需要培養(yǎng)基去除未貼壁細胞，已出現(xiàn)貼壁的ICC待72 h后可以通過ICC特異性標記物c-kit抗體做免疫熒光標記鑒定。具體流程為：將細胞爬片拿出，放置于1%PBS溶液中進行漂洗，重復(fù)3次，共15 min。在室溫條件下，用純度100%丙酮進行固定處理，15 min，待進行風干后放置于1%PBS溶液中進行漂洗，重復(fù)3次，共15 min。0.03%雙氧水H2O2溶液將內(nèi)源性過氧化物酶進行密封處理約0.5h。1%PBS漂洗3次，5min/次。1%胎牛血清白蛋白開展孵化實驗，共0.5h。慢慢吸取孵化液，與經(jīng)過1%PBS稀釋的第一抗體融合（大鼠抗小鼠的單克隆KIT抗體，1∶100，上海百賽生物技術(shù)有限公司）1μl，濕盒內(nèi)室溫孵育2 h后用1%PBS漂洗3次，5 min/次。與經(jīng)過異硫氰酸熒光素標記的熒光第二抗體融合（兔抗大鼠二抗，1∶100，美國Sigma公司）避光孵育60min。1% PBS漂洗3次，5 min/次。在蓋玻片上添加50%甘油溶液，將其封置在載玻片中，利用激光聚焦顯微鏡進行觀察。

1.6 人SCL基因重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染豚鼠膀胱ICC

參照慢病毒轉(zhuǎn)染手冊（由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供），設(shè)置不同感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）（0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0），ICC中加入5×108TU/ml含人SCL基因慢病毒載體，同時加入10μg/ml聚凝胺，置于溫箱中，培養(yǎng)8～12 h后，在顯微鏡下觀察各MOI下的細胞狀態(tài)，棄去培養(yǎng)基，加入新鮮配制的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察ICC生長狀態(tài)并計算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率=[表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的細胞數(shù)/總細胞]×100%，確定最佳MOI值。

將ICC分為空白組、空載體組與實驗組。其中空白組加入1%PBS，空載體組加入空白慢病毒，實驗組按最佳MOI加入含人SCL基因慢病毒載體，同時加入10μg/ml聚凝胺。培養(yǎng)24 h后用移液器吸去培養(yǎng)基，1%PBS漂洗2次，加入1 ml新鮮配制的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染2、3和5 d時，采用激光共聚焦顯微鏡，沿單孔板垂直于水平連續(xù)視野（約0.77 mm2/視野），連續(xù)觀測20個視野（×200），通過觀察GFP表達強度來確定轉(zhuǎn)染效果。

1.7 重組慢病毒GV-287-SCL介導(dǎo)的SCL基因在豚鼠膀胱中的表達

參照慢病毒載體作用時間，各經(jīng)過感染2、3和5 d后，提取實驗組（最佳MOI感染）、空載體組及空白組細胞總RNA，加各組細胞總RNA，加入人SCL基因引物，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作流程進行RT-PCR反應(yīng)。PCR擴增正反向引物和反應(yīng)指數(shù)與上述一致。反應(yīng)結(jié)束后行電泳、凝膠成像及灰度分析，檢測各組ICC中SCL mRNA表達。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人SCL基因擴增的PCR產(chǎn)物

在目的基因SCL進行擴增，擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳實驗，電泳結(jié)果示，PCR擴增產(chǎn)物的長度為1 036 bp，與目的基因相關(guān)片段中的SCL-DNA長度相同。見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL

2.2.1 重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL陽性克隆 抽選8個轉(zhuǎn)化子，通過SCL引物對其行PCR反應(yīng)，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，實驗結(jié)果表明，陽性轉(zhuǎn)化子通過擴增后，都形成503 bp的條帶，其大小與目的片段人SCL cDNA相當，表明8個轉(zhuǎn)化子均接入目的基因，而陰性轉(zhuǎn)化子得到192 bp的條帶。見圖2。

2.2.2 重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL陽性克隆測序測序結(jié)果顯示，目的基因SCL成功插入到GV287-EGFP，將其基因排序進行對比，與GenBank信息庫里的人SCL mRNA完全一致。

2.3 重組慢病毒載體

設(shè)置不同劑量的重組慢病毒載體做轉(zhuǎn)染實驗，了解該重組介質(zhì)對293T細胞的感染情況。轉(zhuǎn)染293T細胞24h后，倒置顯微鏡下觀察GFP成功表達。目的基因融合蛋白大小為39 kD，經(jīng)Western blot檢測，可以觀察到48 kD附近處有特征條帶，其大小和目的基因融合蛋白相比較偏大。實驗結(jié)果表明，該質(zhì)粒用FLAG抗體檢測到目的條帶偏大，蛋白可能存在某種修飾，過表達較好。因此可以看出GV-287-SCL重組慢病毒表達載體可以有效地介導(dǎo)SCL基因蛋白表達。見圖3、4。

圖1 人SCL基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2含人SCL基因的GV287-EGFP陽性克隆瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 不同劑量慢病毒原液感染293T細胞24 h后熒光蛋白的表達 （×100）

圖4 重組慢病毒GV287-SCL感染293T細胞后的蛋白表達

2.4 含人SCL基因重組慢病毒載體滴度

對重組慢病毒顆粒進行反復(fù)感染、外擴和提純，用熒光法檢測并計算病毒滴度，算出病毒滴度為5× 108TU/m。見圖5。

圖5 重組慢病毒GV287-SCL滴度 （×100）

2.5 豚鼠ICC

細胞接種24 h后，可見一些梭形細胞，其兩側(cè)有顯著外凸分支，細胞核較大，細胞質(zhì)中存在一些黑色糖原粒子，其外型規(guī)則，且大部分貼壁生長。上述細胞繼續(xù)培養(yǎng)72h后，ICC特異性標記物c-kit抗體做免疫熒光鑒定試驗，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ICC特異性受體c-kit受體表達成功，證實培養(yǎng)的細胞為ICC。見圖6～8。

2.6 重組慢病毒轉(zhuǎn)染ICC后GFP的表達

含人SCL基因重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC后48 h，激光共聚焦顯微鏡觀察可見強綠色熒光。經(jīng)計算，MOI值為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0時，轉(zhuǎn)染效率分別為（35.42±0.12）%、（58.04±2.28）%、（74.47±3.22）%、（85.62±0.33）%、（90.39±0.67）%和（90.77±0.40）%。MOI值≥10時，轉(zhuǎn)染效率＞85%，與MOI值＜10時的轉(zhuǎn)染效率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。觀察各組細胞生長狀態(tài)，當MOI值≤10時，細胞生長狀態(tài)較好，無細胞死亡，當MOI值≥50時，雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但可見部分細胞死亡，細胞活性降低。結(jié)合各MOI值的轉(zhuǎn)染效率及細胞活性，可確定最佳MOI值為10.0。見圖9。

圖6 培養(yǎng)的豚鼠ICC細胞 （×200）

圖7 酪氨酸蛋白激酶c-kit受體免疫熒光鑒定豚鼠ICC細胞 （×200）

圖8 含人SCL基因重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC 48 h后，激光共聚焦顯微鏡下的豚鼠ICC細胞 （×200）

圖9 不同MOI下轉(zhuǎn)染效率比較

2.7 重組慢病毒轉(zhuǎn)染ICC后SCL mRNA的表達

RT-PCR結(jié)果表明，實驗組中擴增產(chǎn)物長度與目的片段長度（1 036 bp）一致，但是空白組和空載體組都沒有基因表達，表明構(gòu)建SCL基因成功導(dǎo)入ICC。見圖10。

圖10SCL mRNA的表達

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，膀胱ICC可能引起膀胱逼尿肌出現(xiàn)一系列自發(fā)性收縮，該收縮現(xiàn)象完全受到ICC的調(diào)節(jié)，認為膀胱真正的起搏細胞為ICC[10-11]。而在糖尿病病變膀胱中，ICC的數(shù)量和分布異常，導(dǎo)致膀胱功能受損，進而促進DCP形成。ICC表面存在特異性酪氨酸激酶受體c-kit及其配體SCF，兩者結(jié)合后激活SCF/c-kit信號通道，并維持ICC的表型及生理功能。c-kit基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在SCL結(jié)合位點，SCL主要是通過作用于c-kit基因啟動子，調(diào)節(jié)c-kit表達來發(fā)揮其“生存基因”的功能，其對SCF依賴型細胞和CD34+細胞的生存具有重要的調(diào)控作用，可強烈上調(diào)造血細胞、多種干細胞，以及其他多種CD34+細胞表達c-kit。CD34+的TL-1細胞轉(zhuǎn)染反義SCLc DNA后c-kit表達明顯降低，并對SCF失去反應(yīng)性，而SCL過表達則可使c-kit表達升高，并對SCF反應(yīng)性恢復(fù)正常[12]。可見SCL在c-kit表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，通過過表達SCL基因上調(diào)c-kit表達來逆轉(zhuǎn)DCP膀胱中ICC形態(tài)和功能損害具有可靠的理論基礎(chǔ)。

基因治療是在DNA或RNA水平上，人為地將某些外源性的基因?qū)胂鄳?yīng)的靶細胞，從而獲得表達繼而產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)，以達到治療的目的。通過導(dǎo)入外源性SCL基因可以實現(xiàn)對ICC細胞c-kit表達的上調(diào)，促進ICC表型恢復(fù)，具有抑制和逆轉(zhuǎn)ICC損害、治療糖尿病膀胱的可能。本實驗前期研究以腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建人SCL基因重組腺病毒載體，將SCL基因轉(zhuǎn)染入體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的ICC，成功地上調(diào)c-kit基因和蛋白表達，顯著地改善ICC的形態(tài)，減少功能損害[13]。

目前為止，以c-kit為作用靶點，在機體水平探索逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境導(dǎo)致的ICC損害，重塑ICC形態(tài)和功能，治療在體DCP逼尿肌功能異常的相關(guān)研究尚屬空白。SCL基因轉(zhuǎn)染能否重塑DCP中ICC的表型，逆轉(zhuǎn)其形態(tài)、功能損害，并改善在體膀胱的儲、排尿功能，將為臨床治療DCP提供可靠的依據(jù)。隨著基因治療的不斷發(fā)展，慢病毒屬于一個常規(guī)介質(zhì)，可以有效且針對性地對分裂或非分裂細胞實現(xiàn)感染，成功的把外源基因?qū)爰闹骷毎募毎松?，可以體現(xiàn)出周期長、特性穩(wěn)固、表達顯著等特點，能夠用來開展體內(nèi)外實驗[14-15]。本研究采用3質(zhì)粒包裝系統(tǒng)構(gòu)建含人SCL基因的慢病毒載體，該操作方法相對簡單，產(chǎn)物純化度，重組率都相對較高[16]。本實驗采用GFP作為標記蛋白，為實驗提供特異穩(wěn)定、高效的標記。PCR反應(yīng)克隆定向正確，基因全長測序完全正確，說明SCL已定向克隆至慢病毒載體質(zhì)粒中。包裝生產(chǎn)的病毒經(jīng)熒光法滴度測定，滴度達到5× 108TU/mL，符合實驗要求。

研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒轉(zhuǎn)染效果與MOI值密切相關(guān)。慢病毒載體具有一定的細胞毒性，過高的MOI值可導(dǎo)致部分細胞死亡[17]，因此適當?shù)腗OI值很重要。本實驗通過檢測不同MOI值慢病毒轉(zhuǎn)染后ICC的生長狀態(tài)及GFP表達情況，MOI值為10時，GFP表達達高峰，轉(zhuǎn)染效果最佳，是最佳MOI值。繼續(xù)提高MOI值并不能有效增加轉(zhuǎn)染效率，過高MOI值反而導(dǎo)致部分細胞死亡，引起轉(zhuǎn)染效率降低。感染2 d即可見綠色熒光表達，說明目的基因已整合至ICC基因組中，熒光表達在第3天時達高峰，第5天時開始減弱，體現(xiàn)慢病毒載體系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因表達時間長的優(yōu)點。RT-PCR反應(yīng)表明，SCL基因已成功轉(zhuǎn)染至ICC中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。慢病毒轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)染率＞85%，驗證慢病毒載體的高轉(zhuǎn)染效率，也反映出ICC易被轉(zhuǎn)染的特點。通過RT-PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)SCL基因在ICC細胞內(nèi)有表達。筆者推測，采取原代培養(yǎng)ICC，由于其細胞生命周期約為7 d，根據(jù)其生長、衰老規(guī)律，在提取原代細胞培養(yǎng)后第2天進行轉(zhuǎn)染，第4天進行觀察并提取細胞總RNA，可以觀察到較高的轉(zhuǎn)染效率，并檢測到SCL的表達。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建含人SCL基因慢病毒載體，并成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的ICC，獲得較高轉(zhuǎn)染效率，并能介導(dǎo)SCL基因在ICC中的表達，為繼續(xù)研究該基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗提供可靠的實驗工具，更重要的是其有望用于DCP的基因治療。

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（童穎丹 編輯）

Construction of recombinant human stem cell leukemia gene lentiviral vector and its expression in Cajal-like interstitial cells*

Jian-chao Yu,Jiang-ping Wang,Ying-long Li,Biao Qian,Zhao Ni, Xin-min Wang,Qiang Li,Qin-zhang Wang
(Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Medical College, Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

ObjectiveTo construct recombinant lentiviral vectors containing human stem cell leukemia (SCL)gene and to observe its ability in transfecting Cajal-like interstitial cells and mediatingSCLgene expression.Methods TheSCLgene was amplified from plasmid withSCLgene by PCR,connected to the shuttleplasmid GV287-EGFP toconstructGV287-SCL,theobtained replication-defectiverecombinant lentiviral GV287-SCLwas propagated in 293T cells according to the steps of Invitrogen Lipofectamine 2000. The recombinant lentiviral GV287-SCLwas purified and titrated by dilution technique.The transfected Cajallike interstitial cells were culturedin vitro,the distribution and efficiency of recombinant lentiviral mediated SCLwere observed by the expression of green fluorescence protein (GFP)under the fluorescent microscope. RT-PCR were used to measure the expression ofSCLmRNA in the transfected Cajal-like interstitial cells. Results Western blot and gene sequencing confirmed that theSCLgene was successfully inserted into the lentiviral vector,andSCLrecombinant lentiviral vector was successfully transfected into Cajal-like interstitialcells.The adenovirus had a high transfection efficiency of up to 85%when MOI was 10.RT-PCR showed the expression ofSCLmRNA in the Cajal interstitial cells of the experimental group was lower than that of the vector group and the blank group.Conclusions The recombinant lentiviral vector containing humanSCL gene hasbeen successfully constructed by homogenousrecombination in bacteria,and ithasa high transfection efficiency and can mediate expression ofSCLgene in Cajal-like interstitial cells.

stem cell leukemia gene;lentiviral vector;transfection;Cajal-like interstitial cell

R587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.003

1005-8982（2017）06-0010-07

2015-09-14

國家自然科學(xué)基金（No：81360120）

王勤章，E-mail：wqz1969@sina.com