李銘

[摘要]目的 建立測定葆宮止血顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1含量的HPLC法。方法 采用安捷倫Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm），以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長為203 nm。結(jié)果 三七皂苷R1和人參皂苷Rg1，Rb1的線性范圍分別為0.277～5.540 μg（r=0.9998），0.253～5.060 μg（r=0.9998），0.262～5.230 μg（r=0.9997）。平均加樣回收率分別為89.5%（RSD=2.70%）、91.0%（RSD=1.87%）和90.8%（RSD=1.74%）（n=6）。結(jié)論 該方法快速簡便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于葆宮止血顆粒中三七的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]葆宮止血顆粒；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；高效液相色譜法

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（a）-0016-04

[Abstract] Objective To establish the determination of the content of Notoginsenoside R1，Ginsenoside Rg1 and Rb1 in Uterus-Repairing Hemostasis Granules by using HPLC.Methods By using the Agilent Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm），the acetonitrile-water was adopted to perform mobile phase gradient elution at flow rate of 1.0 ml/min；and the detection wavelength was 203 nm.Results The linear scope of Notoginsenoside R1，Ginsenoside Rg1 and Rb1 ranged from 0.277 to 5.540 μg （r=0.9998），from 0.253 to 5.060 μg （r=0.9998），from 0.262 to 5.230 μg （r=0.9997）.The average recovery rate was 89.5% （RSD=2.70%），91.0% （RSD=1.87%） and 90.8% （RSD=1.74%） （n=6）.Conclusion As a simple，reproducible and accurate method，it can be used for quality control of pseudo-ginseng in Uterus-Repairing Hemostasis Granules.

[Key words]Uterus-Repairing Hemostasis Granules；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Rb1；HPLC

葆宮止血顆粒是由牡蠣、白芍、側(cè)柏葉、地黃、金櫻子、柴胡、三七、仙鶴草、椿皮、大青葉等十味藥制成的中藥復(fù)方制劑，為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)中藥第六十九冊收載品種，具有固經(jīng)止血，滋陰清熱之功效，臨床上用于沖任不固、陰虛血熱所致月經(jīng)過多、經(jīng)期延長，經(jīng)色深紅、質(zhì)稠，或有小血塊、腰膝酸軟、咽干口燥、潮熱心煩、舌紅少津、苔少或無苔、脈細(xì)數(shù)；功能性子宮出血及上環(huán)后子宮出血等癥狀。葆宮止血顆粒其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對三七只有薄層鑒別而未做含量測定，為進(jìn)一步完善此產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效地進(jìn)行全面質(zhì)量控制，有必要對三七的有效成分進(jìn)行含量測定。目前測定三七主要有效成分含量的方法多采用高效液相色譜法梯度洗脫[1-17]，選用紫外檢測器[1-14]、蒸發(fā)光檢測器[15-17]進(jìn)行測定。也有用超高效液相色譜法[18]測定三七中的有效成分，但該法對儀器要求比較高，設(shè)備較昂貴，不易普及。本文參考文獻(xiàn)報(bào)道[1-14]，研究建立同時(shí)測定葆宮止血顆粒中三七主要有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1含量的高效液相色譜方法。該方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于該制劑中三七的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

美國安捷倫1260高效液相色譜儀，包括低壓四元梯度泵，真空脫氣機(jī)，二極管陣列紫外檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱；AE240電子分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）

人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-200921，中國食品藥品檢定研究所提供，供含量測定用）；人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201027，中國食品藥品檢定研究所提供，供含量測定用）；三七皂苷R1對照品（批號：110745-201318，中國食品藥品檢定研究所提供，供含量測定用）；葆宮止血顆粒（批號：1403013， 1407050，1505005），為市售品；乙腈為色譜純，水為超純水，其他檢測用試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫，0～60 min（10%～60% A），60～70 min（60% A），70～80 min（60%～10% A），80～95 min（10% A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長為203 nm；進(jìn)樣量為10 μl；柱溫為30℃。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的人參皂苷Rb1對照品10.46 mg，人參皂苷Rg1對照品10.12 mg，三七皂苷R1對照品11.08 mg，分別置于20 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲(chǔ)備液。精密量取上述人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1對照品儲(chǔ)備液各5 ml置20 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1毫升中含人參皂苷Rb1 130.75 μg，人參皂苷Rg1 126.5 μg， 三七皂苷R1 138.5 μg的對照品混合溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品5包內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，稱取約7.5 g細(xì)粉重量，置于50 ml量瓶中，加甲醇約40 ml，超聲處理30 min，取出放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 ml 使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次10 ml，合并正丁醇提取液，用水洗滌2次，每次15 ml，取正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)? ml甲醇分3次溶解轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。

2.2.3三七陰性對照溶液的制備 按藥品標(biāo)準(zhǔn)中的處方和制法制備不含三七的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法操作制備三七陰性對照溶液。

2.3方法專屬性試驗(yàn)

精密量取上述對照品混合溶液，供試品溶液，陰性對照溶液各10 μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果三七皂苷R1的保留時(shí)間為21.3 min，人參皂苷Rg1的保留時(shí)間為22.8 min，人參皂苷Rb1的保留時(shí)間為32.5 min，樣品各組分分離良好，陰性樣品對三七皂苷R1和人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1的測定無干擾，表明此方法的專屬性良好，見圖1。

2.4線性關(guān)系考察試驗(yàn)

分別精密吸取對照品混合溶液2，4，10，20，40 μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程Y人參皂苷Rb1=2.26×102X+0.446（r=0.9997），Y人參皂苷Rg1=6.44×102X+0.50（r=0.9998），Y三七皂苷R1=1.41×102X+0.17（r=0.9998）。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1峰面積與進(jìn)樣量在0.262～5.230 μg，0.253～5.060 μg，0.277～5.540 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

取對照品混合溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得三七皂苷R1峰面積的RSD為0.51%，人參皂苷Rg1峰面積的RSD為0.42%，人參皂苷Rb1峰面積的RSD為0.66%，表明分析方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液10 μl，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行測定，按上述色譜條件下測定，記錄峰面積。結(jié)果三七皂苷R1峰面積的RSD為0.84%，人參皂苷Rg1峰面積的RSD為0.75%，人參皂苷Rb1峰面積的RSD為1.1%。測定結(jié)果表明在12 h內(nèi)供試品溶液中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積無明顯變化，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號樣品（批號：1403013）共6份，按供試品溶液的制備方法平行配制六份供試品溶液，同法測定，測得三七皂苷R1的含量為3.72 mg/包，RSD為2.33%，人參皂苷Rg1的含量為3.38 mg/包，RSD為1.75%，人參皂苷Rb1的含量為4.10 mg/包，RSD為1.88%，表明方法有較好的重復(fù)性。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取同一批號（批號：1403013，平均裝量：15.316 g/包）的已知含量樣品5包，取顆粒研細(xì)混勻，稱取約3.75 g細(xì)粉重量，精密稱定，共6份，分別置50 ml量瓶中，精密加入上述3種對照品儲(chǔ)備液各1 ml，加甲醇約40 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，按上述色譜條件下測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的平均回收率分別為89.5%（RSD為2.70%），91.0%（RSD為1.87%），90.8%（RSD為1.74%）（表1）。

2.9樣品含量測定

分別精密稱取不同批的葆宮止血顆粒，按上述供試品溶液的制備方法配制供試品溶液，分別精密吸取對照品混合溶液和供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。3個(gè)批號樣品中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1的含量測定結(jié)果見表2。

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇

由于本品為中藥復(fù)方制劑，影響含量測定的干擾因素也較多，色譜圖中的峰較多，故對分離度要求較高。參考文獻(xiàn)[1-4]方法中的流動(dòng)相測定均不理想。后經(jīng)過探索乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸溶液，甲醇-0.1%磷酸溶液等不同的洗脫體系，不同的梯度洗脫程序，最終采用乙腈-水洗脫體系，按方法“2.1”項(xiàng)下的梯度洗脫程序使三七中3種主要的皂苷類成分獲得完全分離，峰形、理論板數(shù)都比較理想，基線漂移不明顯，該色譜條件可用于該制劑的含量測定。

3.2 檢測波長的選擇

通過紫外掃描，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三者均在200～210 nm有較大吸收峰，再通過實(shí)驗(yàn)考察表明在波長為203 nm時(shí)三者均有較好的響應(yīng)值，故本實(shí)驗(yàn)選擇檢測波長為203 nm。

3.3樣品的提取

文獻(xiàn)報(bào)道中樣品的提取方法有甲醇超聲提取[5-8]、70%乙醇超聲提取[9]、水飽和的正丁醇超聲提取[10]、甲醇微沸2 h提取[11]、甲醇加熱回流1～2 h提取[12-14]。由于樣品中的三七總皂苷易溶于甲醇，綜合考慮操作的簡便，采取對樣品加甲醇進(jìn)行超聲提取，本實(shí)驗(yàn)通過對不同超聲提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示超聲提取30 min就可使樣品中的三七總皂苷完全提取出來，提取液經(jīng)水浴蒸干，殘?jiān)铀芙夂螅儆盟柡偷恼〈颊駬u提取，去除樣品中的一些其他成分干擾，本實(shí)驗(yàn)通過對不同水飽和的正丁醇提取液體積（20，10 ml），提取次數(shù)（2，3次）的進(jìn)行考察，經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察用水飽和的正丁醇提取3次（10，10，10 ml）就可將三七總皂苷提取完全。

3.4檢測器的選擇

相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]采用蒸發(fā)光散射檢測器測定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，其作為一種通用型檢測器，由于流動(dòng)相在檢測前就已蒸發(fā)，提高了基線的穩(wěn)定性，不會(huì)產(chǎn)生基線漂移，但由于該檢測器的基線噪音大，也影響了檢測的靈敏度，而采用紫外檢測器，基線噪音小，并且采用合理的梯度洗脫程序，使得基線漂移并不明顯。另外蒸發(fā)光散射檢測器測定時(shí)樣品濃度與峰面積呈對數(shù)線性關(guān)系，因此要采用對數(shù)計(jì)算。考慮測定和計(jì)算的簡便性，最終采用紫外檢測器進(jìn)行測定。

3.5本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法梯度洗脫同時(shí)測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，經(jīng)方法學(xué)研究，結(jié)果表明該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，回收率好，專屬性較強(qiáng)。且方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于葆宮止血顆粒中三七的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2016-12-09 本文編輯：顧雪菲）