彭曉宇

（ 山東省榮成市嶗山畜牧獸醫(yī)站，山東 榮成 264300）

牛胚胎的解凍、鑒定與移植

彭曉宇

（ 山東省榮成市嶗山畜牧獸醫(yī)站，山東 榮成 264300）

1 受體牛的選擇與處理

牛胚胎移植的妊娠率與受體的選擇密切相關(guān)。建議選擇3~8歲、健康無病、體格較大、膘度適中的受體牛。健康的身體、無菌的子宮環(huán)境是進(jìn)行胚胎移植的基礎(chǔ)。繁殖性能正常，至少要有兩次以上且自然發(fā)情記錄。泌乳良好，無流產(chǎn)、難產(chǎn)史，杜絕使用兩次人工受精未孕的牛。這是胚胎能否在子宮附植的關(guān)鍵。受體牛要精心飼養(yǎng)，合理飼喂，草料和飲水要新鮮干凈，補(bǔ)充必要的食鹽和添加劑。圈舍清潔干凈，防止過度擁擠，適當(dāng)運(yùn)動，細(xì)心觀察。在移植前后防止各種應(yīng)激反應(yīng)。良好的飼養(yǎng)環(huán)境和體況是保證胚胎移植后胎兒發(fā)育的基礎(chǔ)。

受體牛的同期發(fā)情處理。使用新西蘭產(chǎn)品CIDR陰道栓，同時每頭牛肌注VA、VD、VE各1 0 mL，9 d后注射氯前列烯醇0.6 mL，同時再注射VA、VD、VE各10 mL·頭-1，第12天后抽栓，1~2 d后觀察牛的發(fā)情情況，2~3 d后受體牛幾乎全部發(fā)情。對發(fā)情牛需做直腸檢查，以確認(rèn)卵泡，若在發(fā)情后1.5 d以后排卵的不能用作受體牛。

2 冷凍胚胎的解凍

三步平衡法凍胚的解凍。將10%、6%和3%甘油的PBS（培養(yǎng)液）保存液，濾器滅菌，分裝在小培養(yǎng)皿內(nèi)，第1杯為含10%甘油的PBS保存液，第2杯為含6%甘油的PBS保存液，第3杯為含3%甘油的PBS保存液，第4杯為不含甘油的PBS保存液。胚胎從液氮中取出在3 s內(nèi)投入38℃水浴浸10 s。 用棉球粘70%酒精對塑料吸管和剪刀刃進(jìn)行消毒，剪去棉塞端，與帶有空氣的1 mL注射器連接上。再剪去吸管的另一端，在室溫下將胚胎推入10%甘油和0.3 mol·L-1蔗糖PBS保存液中，放置5 min，以后陸續(xù)移入6%和3%甘油蔗糖的PBS保存液中，各放置5 min，最后移至不含甘油的PBS保存液中鏡檢待用。

3 復(fù)蘇后胚胎的鑒定

胚胎質(zhì)量與胚胎復(fù)蘇正相關(guān)。在100~200倍實體解剖顯微鏡下觀察受精卵的形態(tài)、色調(diào)、分裂球的大小、均勻度、細(xì)胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等。凡卵子的卵黃未形成分裂球及細(xì)胞團(tuán)的，均列為未受精卵。通常受精后6~8 d非手術(shù)回收的正常受精卵（桑椹胚、致密桑椹胚、早期囊胚、囊胚、擴(kuò)大囊胚、孵育胚）發(fā)育情況要進(jìn)行仔細(xì)鑒定。凡在發(fā)情后6~8 d回收的16細(xì)胞以下的受精卵均應(yīng)列為非正常發(fā)育卵，不能用于移植。

4 胚胎移植

胚胎可在回收后立即移植給受體，也可冷凍保存，以后再移植。IETS的資料表明，回收的胚胎約有一半是以鮮胚移植，另一半則冷凍保存，但冷凍保存的胚胎大多數(shù)未解凍移植，可能是因為與隨后的后代相比，這些胚胎的遺傳價值降低，因此沒有必要再進(jìn)行移植。

一直到20世紀(jì)70年代中期，胚胎多通過腹中線切口，或后來通過腹脅部切口，通過手術(shù)法移植到受體子宮角尖端。這些方法，尤其是腹中部切口法，比較麻煩，而且動物也得承受較大的手術(shù)風(fēng)險。此后，幾乎所有的牛胚胎都是采用非手術(shù)法，經(jīng)子宮頸進(jìn)行移植，其妊娠率與手術(shù)法移植后的相似，為50%~60%。

根據(jù)IETS胚胎移植操作手冊，胚胎在移植前，應(yīng)先洗滌10次，之后將每個胚胎裝入0.25 mL的無菌人工授精細(xì)管（IMV）中，再將裝有胚胎的細(xì)管置入普通的人工授精槍（卡蘇槍）或?qū)榕咛ヒ浦苍O(shè)計的由普通輸精導(dǎo)管改制的導(dǎo)管中。

受體的發(fā)情周期必須要與供體的同步化，進(jìn)行胚胎移植之前應(yīng)確保受體的發(fā)情發(fā)生在供體發(fā)情時間的±24 h之內(nèi)，并且存在有功能性黃體。與發(fā)情的同步化相比，受體與胚胎發(fā)育階段的同步化是一個更為可靠的參數(shù)。例如，桑葚胚應(yīng)該在受體發(fā)情周期的第6天移植，而囊胚則應(yīng)在第7天移植給受體。

受體可采用硬膜外麻醉，而且與供體一樣，應(yīng)當(dāng)仔細(xì)清洗干凈其會陰部。在牛，為了阻止溶黃體機(jī)制的發(fā)生，胚胎常被移植在有黃體發(fā)育一側(cè)的子宮角。操作人員先把帶有薄塑料鞘套的胚胎移植導(dǎo)管，采用直腸把握法經(jīng)陰道小心插入子宮角中部，然后把胚胎置于此。采用該技術(shù)移植胚胎時，應(yīng)輕輕地將導(dǎo)管推入子宮腔，并輕輕將子宮角牽拉向?qū)Ч堋?yīng)避免引起子宮內(nèi)膜損傷出血。就妊娠率而言（平均50%~70%），不同的操作人員、不同的養(yǎng)殖場之間差異很大，特別是胚胎質(zhì)量影響更大，優(yōu)質(zhì)和良好的胚胎移植后的妊娠率最高（70%~80%）。

胚胎移植后超過妊娠45 d的妊娠失敗率大約為5%，這與人工授精的結(jié)果非常接近，劣質(zhì)胚胎及冷凍胚胎的妊娠失敗率更高。

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1001-0084（2017）11-0049-01

2017-10-17

彭曉宇（1989-）女，山東榮成人，初級畜牧師，主要從事畜牧工作。