曹玉謙 李長莉

（遼寧省丹東市林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧丹東118011）

布勒雜交現(xiàn)象是由世界著名真菌學(xué)家布勒（Buller）先生于1931年研究發(fā)現(xiàn)的，布勒雜交是指同種擔(dān)子菌的雙核菌絲與單核菌絲相互接觸后，雙核菌絲細(xì)胞中一個(gè)核遷移到單核菌絲細(xì)胞中使之雙核化，產(chǎn)生新菌株的過程。滑菇（Pholiota nameko）布勒雜交育種，是針對遼寧地區(qū)滑菇品種使用時(shí)間較長，在產(chǎn)量、品質(zhì)及抗病性狀上已出現(xiàn)不同程度的退化現(xiàn)象進(jìn)行的，旨在通過研發(fā)滑菇布勒雜交育種技術(shù)來培育滑菇優(yōu)良菌株。筆者歷時(shí)八年（2007-2015年），育出了丹滑16號(hào)滑菇新菌株。

1 材料與方法

1.1 供試滑菇菌株選擇生產(chǎn)上正在應(yīng)用的滑菇菌株和尚未在生產(chǎn)上應(yīng)用的單孢雜交菌株，以及野生滑菇菌株野生1號(hào)、野生2號(hào)等8個(gè)雜交親本。對照菌株為生產(chǎn)上正在使用的滑菇C3-1，具體各親本主要性狀和來源見表1。

表1 滑菇布勒雜交親本主要性狀及來源

1.2 培養(yǎng)基①PDA培養(yǎng)基：用于孢子萌發(fā)培養(yǎng)；②雜交培養(yǎng)基：自主研發(fā)，用于滑菇雜交；③馬鈴薯綜合培養(yǎng)基：用于雜交菌絲純化培養(yǎng)；④二、三級(jí)種培養(yǎng)基：木屑78%，麩皮20%，石膏1%，蔗糖1%。料含水量62%～63%；⑤栽培培養(yǎng)基：木屑80%，麩皮19%，石膏1%。料含水量62%～64%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 親本的拮抗檢驗(yàn) 將選定的滑菇親本在PDA試管斜面上逐一做拮抗檢驗(yàn)，觀察是否產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象，凡是產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象的，就可以作為雜交親本。

1.3.2 滑菇布勒雜交菌株的培育 培育方法參照參考文獻(xiàn)[2]，其中確定為單核親本的滑菇有野生1號(hào)、丹滑15號(hào)和C3-1，且進(jìn)行半熟料栽培。選育出菌株的栽培小試采用高30 cm，直徑13 cm袋，培養(yǎng)料濕重2.5 kg，干料重0.95 kg的木屑半熟料袋栽；重復(fù)小試則采用菌盤長55 cm，寬35 cm，厚3.0 cm，培養(yǎng)料濕重4.5～4.7 kg，干料重1.7 kg的半熟料盤式栽培。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交親本的拮抗檢驗(yàn)8個(gè)親本的28組拮抗檢驗(yàn)結(jié)果表明：每一組檢驗(yàn)的5次重復(fù)均有拮抗現(xiàn)象發(fā)生，證明它們是不同的菌株，可作為雜交親本。

2.2 雜交異核體的培育2009年8月完成了400個(gè)布勒雜交配對工作，通過培養(yǎng)觀察，剔除了91個(gè)不親和組合，通過顯微鏡觀察淘汰了111個(gè)無鎖狀聯(lián)合的組合。馬鈴薯綜合培養(yǎng)基及木屑基質(zhì)出菇檢驗(yàn)，檢出了67個(gè)生長不良或不出菇的個(gè)體，保留了131個(gè)雜交異核體。

2.3 栽培小試2011年采用半熟料袋栽模式進(jìn)行小試。當(dāng)年11月末出菇結(jié)束。自此，將小試正常出菇的異核體初步確定為雜交菌株。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果遴選出綜合性狀突出的9個(gè)雜交菌株，其主要性狀見表2。

表2 9個(gè)滑菇布勒雜交菌株的主要性狀

表2可看出，9個(gè)菌株的平均袋單產(chǎn)514～572 g，比對照高出0.8%～12.1%；平均單菇重2.4～4.3 g，比對照高出9.0%～95.4%；出菇方式、菌蓋顏色、菌蓋粘液等性狀與對照相似或相近。

2.4 雜交異核體與親本的拮抗檢驗(yàn)將9個(gè)雜交異核體分別與各自的親本進(jìn)行拮抗檢驗(yàn)，以進(jìn)一步確定它們是否雜交新菌株，產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象者即可確定為新菌株。結(jié)果表明：被檢的9個(gè)異核體，與各自的兩個(gè)親本都產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象。因此，進(jìn)一步確定它們是雜交新菌株。

2.5 DNA檢測結(jié)果與分析經(jīng)過重復(fù)小試選出B52和B17兩個(gè)新菌株。為準(zhǔn)確確定B52和B17是否雜交新菌株，對其進(jìn)行DNA檢測。

將ISSR分子標(biāo)記與SRAP分子標(biāo)記結(jié)合來看，綜合了49條引物擴(kuò)增出的293條DNA片段，其中多態(tài)性條帶135條。用NTSYSpc 2.10軟件對5個(gè)供試菌株進(jìn)行聚類分析，獲得各菌株間的聚類圖（圖1）。

圖1 ISSR和SRAP結(jié)合對五種相似系數(shù)滑子菇分子標(biāo)記的聚類分析

從圖1中，明顯看到雜交種B52與親本野生一號(hào)和親本Ph25相似性很低，可以判斷B52與親本相比產(chǎn)生新的變化。同樣，雜交種B17與親本野生一號(hào)相似性在0.75左右，與SRAP結(jié)果相同（分析略），與ISSR結(jié)果相差0.05的相似性，與親本Ph08的相似性在0.86左右，與ISSR和SRAP單獨(dú)分析結(jié)果基本一致（分析略）。由此判斷B17與親本相比有明顯變化。

雜交種B52和雜交種B17與各自親本相比，在遺傳上存在的明顯的分化，證明了其為雜交新菌株。

2.6 中試結(jié)果與分析

2.6.1 丹滑16號(hào)產(chǎn)量穩(wěn)定性分析 為了擴(kuò)大菌株B52和菌株B17的影響，將其分別命名為丹滑16號(hào)和丹滑17號(hào)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，丹滑16號(hào)比丹滑17號(hào)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗高溫能力，因此著重進(jìn)行丹滑16號(hào)菌株的中試試驗(yàn)。為了驗(yàn)證丹滑16號(hào)性狀的穩(wěn)定性，連續(xù)三年（2013-2015年）在不同地區(qū)進(jìn)行丹滑16號(hào)的中試，產(chǎn)量結(jié)果見表3。

表3 丹滑16號(hào)中試基點(diǎn)產(chǎn)量 kg/盤

從表3的結(jié)果可看出：丹滑16號(hào)在2013年、2014年、2015年各基點(diǎn)的平均單產(chǎn)分別為2.17 kg/盤、2.14 kg/盤、2.10 kg/盤，三年總平均值為 2.14 kg/盤。方差分析結(jié)果表明：F=0.4594，F(xiàn)0.05（3，8）=4.07，差異不顯著。由此可見：丹滑16號(hào)在中試基點(diǎn)三年的平均單產(chǎn)是穩(wěn)定的，因而具備了高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)良特性。

2.6.2 丹滑16號(hào)中試基點(diǎn)的保盤率 表5的結(jié)果表明：丹滑16號(hào)在各中試基點(diǎn)的保盤率為97.8%，對照為92%，比對照高出5.8%。方差分析結(jié)果表明：F=40.97，F(xiàn)0.01（7，16）=4.03，F(xiàn)＞F0.01（7，16），丹滑16號(hào)與對照的差異極顯著。由此可見，丹滑16號(hào)抗高溫、抗雜菌能力顯著高于對照。

表4 丹滑16號(hào)中試產(chǎn)量方差分析

表5 丹滑16號(hào)中試基點(diǎn)的保盤率%

表6 丹滑16號(hào)保盤率方差分析

2.6.3 丹滑16號(hào)子實(shí)體的性狀 丹滑16號(hào)（圖2）與對照的性狀對比見表7。

表7 丹滑16號(hào)與對照子實(shí)體的性狀對比

從表7可看出，丹滑16號(hào)的品質(zhì)高于對照，菌蓋橘紅色，單個(gè)子實(shí)體較大，菌柄長短比對照更為適度，菌柄較粗。在正常情況下，菌柄粗者子實(shí)體健壯，不易開傘?；谝陨咸攸c(diǎn)，該菌株適合多種加工方式要求。

圖2 丹滑16號(hào)出菇場景

3 小結(jié)與討論

首次研發(fā)滑菇布勒雜交育種技術(shù)，并且成功育出滑菇新菌株。結(jié)果證明，運(yùn)用布勒雜交技術(shù)進(jìn)行滑菇育種是可行的，育出的滑菇新菌株達(dá)到了高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和性狀穩(wěn)定的育種目標(biāo)。

應(yīng)用布勒雜交技術(shù)培育出丹滑16號(hào)新菌株，具有發(fā)菌快、抗高溫抗雜菌能力強(qiáng)、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)范圍廣、性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)。丹滑16號(hào)中試平均單產(chǎn)為2.14 kg/盤，生物轉(zhuǎn)化率為125.8%，在滑菇生產(chǎn)上取得了理想的應(yīng)用效果。