熊榮川 喻廷君 李正富 曹 東 任梅梅 詹秀秀

（1六盤水師范學院生物科學與技術學院，貴州六盤水553001；2六盤水市生物研究所，貴州六盤水553001；3貴州大學昆蟲研究所，貴陽550025；4水城縣石丫口小學，貴州六盤水553000）

中華蟾蜍（Bufo gargarizans）隸屬蟾蜍科（Bufonidae）蟾蜍屬（Bufo），包含三個亞種，即指名亞種（Bufo gararizans gararizans）、華西亞種（Bufo gararizans andrewsi）以及岷山亞種（Bufo gararizans minshanicus）。中華蟾蜍在貴州省記載有兩個亞種，即指名亞種（Bufo gararizans gararizans）及華西亞種（Bufo gararizans andrewsi）。指名亞種分布于遵義、綏陽、正安、仁懷、赤水、江口、印江、德江、松桃、水城、畢節(jié)、大方、金沙、雷山、貴定、貴陽、務川等地；而華西亞種分布于威寧、興義、荔波、綏陽、江口等（費梁等，2009）。已有的分子遺傳研究報道了綏陽、江口和威寧種群的分子數(shù)據(jù)，3個種群分別屬于不同的支系（Fu J Z等，2005；Zhan A B，F(xiàn)u J Z，2011；熊榮川 等，2014）。本研究針對采自貴州省水城縣米籮鄉(xiāng)的蟾蜍標本進行DNA提取，并克隆其線粒體16S rRNA基因，對其物種進行準確而有效的鑒定。

1 材料與方法

1.1 標本信息

研究材料于2014年6月1日采自貴州省水城縣米籮鄉(xiāng)石丫口民裕小學附近（標本號：LPSSC130563、LPSSC130564），標本保存于六盤水師范學院生物科學與技術學院標本館。

1.2 總DNA提取及目的基因片段的擴增

取標本腿部新鮮肌肉組織適量，經(jīng)90%濃度酒精固定后，使用動物組織DNA提取試劑盒（FOREGENE，DE-05011：250 Preps）提 取 總DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

擴增引物為1對無尾兩棲動物通用的線粒體16S rRNA片段擴增引物（Simons C等，1994）。所擴增目的序列對應中華蟾蜍線粒體基因組（Genbank索取號KM587710）2135-2675bp區(qū)間位置，對應中華蟾蜍16S rRNA全基因（Genbank索取號KM587710）856-1396bp區(qū)間位置。

PCR反應條件：反應體積為50 ul，其中北京全式金公司配備反應緩沖液2×EasyTaq PCR Super-Mix 25 ul，總DNA模板2 ul（含10～100 ng），上、下游引物各2ul（10 uM），用ddH2O補足50 ul。擴增PCR反應程序為94℃預變性4 min；94℃變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸40 s，循環(huán)次數(shù)為35次；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送測序公司測序。

1.3 參考基因序列下載及系統(tǒng)發(fā)育分析

所測得的中華蟾蜍16S基因序列經(jīng)過上傳GenBank進行搜索比對（Megablast）獲得100條初步的參考序列，與待定基因序列一起構成數(shù)據(jù)集。進行系統(tǒng)發(fā)育分析時不預先設定外群，構建一棵無根系統(tǒng)發(fā)育樹。用MUSCLE（Edgar R C，2004）程序對序列進行比對，輔以人工校對。使用raxmlGUΙ1.3（Silvestro D，Michalak Ι，2012）軟件構建最大似然樹，使用Mrbayes3.2（Ronquist F等，2012）構建貝葉斯樹。在jModelTest 2（Darriba D等，2012）中篩選最適合該數(shù)據(jù)集序列演化模型以供最大似然法（Maximum likelihood，ML）分析和貝葉斯分析（Bayesian inference methods）。根據(jù)AΙC標準，適合本數(shù)據(jù)集的模型TΙM2+Ι+G。使用構建最大似然樹（maximum likelihood tree），由于該軟件不支持TΙM2+Ι+G模型，使用次優(yōu)模型GTR+Ι+G，其中Ι=0.462，G=0.567。最大似然樹支持率大于75%表明該支系關系得到充分解決，在50%～70%之間為中度支持，否則視為未解決。貝葉斯樹支持率大于95%表明該支系關系得到充分解決，在75%～95%之間為中度支持，否則視為未解決。

1.4 遺傳距離的計算

選用MEGA6（Tamura K等，2013）分析各序列間差異，依據(jù)Kimura2-parameter模型計算兩兩序列間的遺傳距離以及主要支系間的平均遺傳距離。

2 研究結果及分析

2.1 PCR擴增及測序結果

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物P7/P8擴增到560bp左右的基因片段（GenBank索取號：KX870122，KX870123）?；蛐蛄校▎捂湥A基組成存在明顯的偏向性：AT含量較高（A：30.6%，T：25.5%）；GC含量較低（G：19.7%，C：24.2%）。

2.2 支系分化

將所測得蟾蜍16S基因序列提交Genbank進行搜索比對，其與Genbank中的已有中華蟾蜍序列相似度最高，下載搜索得到的100條同源序列與待鑒定目標序列構成16S序列數(shù)據(jù)集?；谠摂?shù)據(jù)集構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖1），56條來自Bufo bufo和Bufo eichwaldi參考序列聚為一個單系，將之設置為外群；另外包含目標序列在內(nèi)的46條序列構成一個支持率較高的單系，該單系在系統(tǒng)發(fā)育分析中作為內(nèi)群（各序列的Genbank索取號及采集地點已標注于圖1）。

基于最大似然法和貝葉斯法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結構基本一致（圖1），內(nèi)群內(nèi)部均聚為7個主要支系：支系L.A包含了中華大蟾蜍水城種群、中國東部、北部地區(qū)種群以及四川康定和丹巴兩種群（支系內(nèi)遺傳距離均值0.008）；支系L.B主要包含了中華大蟾蜍俄羅斯遠東種群、韓國種群以及中國東北部地區(qū)種群（支系內(nèi)遺傳距離均值0.003）；支系L.C主要包含了中華大蟾蜍云南昆明種群；支系L.D主要包含了中華大蟾蜍云南怒江、中甸及四川石棉種群（支系內(nèi)遺傳距離均值0.005）；支系L.S主要包含了分布于中國遼寧和韓國江原道地區(qū)的史氏蟾蜍（Bufo stejnegeri）種群（支系內(nèi)遺傳距離均值0）；L1和L2為兩個日本蟾蜍支系（支系內(nèi)遺傳距離均值分別為0.018和0.014）。

基于16S序列的遺傳距離（表1）表明，內(nèi)外群間平均遺傳距離為0.059；內(nèi)群各支系間平均遺傳距離為0.028～0.051.

圖1 基于16SrRNA的蟾蜍類物種的最大似然樹。支系附近數(shù)字表示各主要支系的支持率（最大似然率/貝葉斯后驗概率），-表示沒有數(shù)據(jù)。Fig.1 The maximum likelihood(ML)tree based on the 16SrRNAfromBofospecies.Numbers around the branches are statistical supports(ML bootstrap values/Bayesian posterior probability),-means no available data.

表1 本研究中內(nèi)群各支系間平均遺傳距離Table 1 The average genetic distances among the lineages of the ingroup in this study.

3 結論及討論

本研究成功擴增了水城縣米籮鄉(xiāng)分布蟾蜍的線粒體16S rRNA基因，經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育分析，其與44條蟾蜍序列構成一個支持率較高的單系群，該單系群進一步分化為7個主要支系，水城種群所在的L.A支系最大似然法支持率較低（41）；但得到貝葉斯推斷法的中度支持（0.83）。同時，該支系內(nèi)部序列間平均遺傳距離為0.008，遠小于該支系與其他支系間的平均遺傳距離（0.29～0.42），因此可以初步判斷水城種群與該支系內(nèi)其他種群為同一個物種。

支系L.A包含的序列分別被原始研究鑒定為中華蟾蜍（Bufo gargarizans）（Liu W Z等，2000；Jiang J P，Zhou K Y，2005；Cao S等，2006；Ιgawa T等，2006；Yang J等，2015）、盤古蟾蜍（Bufo bankorensis）（Liu W Z等，2000；Ιgawa T等，2006；Recuero E等，2012）、西藏蟾蜍（Bufo tibetanus）（Wang X等，2013）。然而有研究認為盤古蟾蜍和西藏蟾蜍是中華蟾蜍的同物異名（Matsui M，1986；Liu W Z等，2000；Zhan A B，F(xiàn)u J Z，2011），因此支系L.A的物種應為中華蟾蜍，由此得出采自水城米籮鄉(xiāng)的蟾蜍標本為中華蟾蜍（Bufo gargarizans）。

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