余慧宏，宋建新，黃潔瓊

(景德鎮(zhèn)市疾病預(yù)防控制中心，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

日常沙門菌血清分型思路于一次盲樣考核中的應(yīng)用

余慧宏，宋建新，黃潔瓊

(景德鎮(zhèn)市疾病預(yù)防控制中心，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

目的 通過梳理日常沙門菌血清分型思路及總結(jié)積累的經(jīng)驗(yàn)，借以探討考核樣本中沙門菌血清分型方法。方法采用GB4789.4-2010沙門菌檢驗(yàn)位相變異試驗(yàn)簡(jiǎn)易平板法，作為參考方法。同時(shí)運(yùn)用傳代與簡(jiǎn)易平板法相結(jié)合的方法，以及血平板-濾紙條搭橋法進(jìn)行鑒定。結(jié)果 運(yùn)用傳代與簡(jiǎn)易平板法相結(jié)合的方法和血平板-濾紙條搭橋法，一次性誘導(dǎo)鑒定出準(zhǔn)確的沙門菌血清型。簡(jiǎn)易平板法誘導(dǎo)三次得出菌型。結(jié)論 經(jīng)過這次考核樣的檢測(cè)，提高了檢驗(yàn)人員對(duì)沙門菌血清型的鑒定水平，提升了解決位相變異試驗(yàn)所遇難題的能力。

盲樣考核；沙門菌；血清學(xué)分型；質(zhì)量控制

室間質(zhì)量評(píng)價(jià)是由專門機(jī)構(gòu)采用一系列辦法，比較和評(píng)價(jià)地區(qū)間、省內(nèi)或全國(guó)范圍內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)質(zhì)量。近十年來，本實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)參加了不同范圍內(nèi)的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)考核。對(duì)于考核盲樣中分離出，僅出現(xiàn)一相鞭毛抗原的沙門菌，應(yīng)用簡(jiǎn)易平板法[1-3]，均可一次成功誘導(dǎo)出另一相鞭毛抗原，繼而將簡(jiǎn)易平板法，應(yīng)用于日常工作分離的沙門菌血清型鑒定中。在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，有的沙門菌須誘導(dǎo)三次，甚至三次以上才可成功，這樣不僅費(fèi)力，而且費(fèi)時(shí)。有此經(jīng)驗(yàn)后，為了能在考核規(guī)定時(shí)間內(nèi)得出沙門菌血清型，在運(yùn)用簡(jiǎn)易平板法作為參考方法的同時(shí)，還引用了其他方法進(jìn)行誘導(dǎo)，并順利完成沙門菌菌型鑒定，現(xiàn)將情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源2016年細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)價(jià)考核中，江西省疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的，需進(jìn)行病原菌檢測(cè)的一份盲樣。按照考核樣品作業(yè)指導(dǎo)書要求，對(duì)腸道、呼吸道病原菌分離培養(yǎng)及鑒定，須鑒定到種或型。通過分離培養(yǎng)，得到一株腸道致病菌，經(jīng)鑒定為沙門菌（8：r：-）。 查閱抗原表后知，需進(jìn)行位相變異試驗(yàn)誘導(dǎo)出另一相鞭毛抗原，才能判定血清型。

1.2 主要試劑和儀器血平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；三糖鐵瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、半固體瓊脂均由青島海博試劑有限公司生產(chǎn)；沙門菌屬診斷血清（60種）由寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司提供；小刀、眼科小鑷子、普通濾紙剪成10mm×15mm的長(zhǎng)方形濾紙條均由本實(shí)驗(yàn)室高壓滅菌。

1.3 方法

1.3.1 采用GB4789.4-2010沙門菌檢驗(yàn)位相變異試驗(yàn)簡(jiǎn)易平板法。將半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取因子血清（Hr）1環(huán)，加在半固體平板表面，放置溫箱片刻，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位點(diǎn)種待檢菌株，因誘導(dǎo)平板瓊脂含量少，加之新鮮配制的緣故，放入培養(yǎng)箱時(shí)，不可倒置培養(yǎng)。36℃培養(yǎng)24～48h，取形成蔓延生長(zhǎng)的菌苔邊緣菌檢查。當(dāng)凝集效價(jià)低或菌量難以達(dá)到血清學(xué)試驗(yàn)要求時(shí)，出現(xiàn)不容易判讀的情況，則把遠(yuǎn)端菌接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)后鑒定。未出現(xiàn)第二相鞭毛抗原，則如前所述程序再誘導(dǎo)一次，直至出現(xiàn)第二相鞭毛抗原。

1.3.2 傳代與簡(jiǎn)易平板法相結(jié)合的做法將沙門菌于三糖鐵瓊脂上傳代，36℃培養(yǎng)18～24h后，刮取菌苔進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)，未出現(xiàn)另一相鞭毛抗原，再傳代培養(yǎng)后，仍未出現(xiàn)第二相鞭毛抗原，則挑取菌苔按簡(jiǎn)易平板法進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.3.3 依照文獻(xiàn)介紹的血平板-濾紙條搭橋法進(jìn)行[4，5]。在血平板上，用小刀劃出兩條距離7～8mm的平行線，平行線均貫穿血平板，將兩平行線間的瓊脂掏出，手拿鑷子將濾紙條長(zhǎng)邊橫跨溝槽，緊貼于兩邊瓊脂上。濾紙中央滴加已知相鞭毛抗原的診斷血清（Hr）約 50μl，刮取菌苔接種于溝槽一端的濾紙邊緣（作為原點(diǎn)），平板放入36℃恒溫箱，倒置培養(yǎng)18～24h，取原點(diǎn)彼岸菌苔進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。

2 結(jié)果

簡(jiǎn)易平板法誘導(dǎo)三次得出菌型，沙門菌傳代與簡(jiǎn)易平板法相結(jié)合的做法和血平板搭橋法，一次性誘導(dǎo)成功，較簡(jiǎn)易平板法提前2～3d，鑒定出準(zhǔn)確的沙門菌血清型，為黃金海岸沙門菌（8：r：l，w）。

3 討論

盲樣考核是對(duì)檢測(cè)人員技能、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制情況的一種檢驗(yàn)[6-8]，要求我們注重平時(shí)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制工作，如儀器的維護(hù)和檢定校準(zhǔn)、培養(yǎng)基和診斷血清的質(zhì)量控制等。診斷血清對(duì)病原菌鑒定非常關(guān)鍵，血清實(shí)則是蛋白質(zhì)，需要避開引起蛋白質(zhì)變性的不利因素，夏天長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)，最好放置在經(jīng)過冷藏的冰袋上，嚴(yán)格無菌操作，防止污染，任何混濁與顏色改變，應(yīng)視為雜菌污染，不應(yīng)使用。

本次盲樣考核樣品中分離出腸道病原菌沙門菌。沙門菌分類原則是以O(shè)抗原來分群，每群再以H抗原來分型[9]，大多數(shù)沙門菌是有動(dòng)力的，而且多數(shù)為雙相菌，具有2個(gè)位相的沙門菌可出現(xiàn)位相變異，在一定條件下自發(fā)地出現(xiàn)相互轉(zhuǎn)變，加已知相的抗血清培養(yǎng)出另一位相的方法，簡(jiǎn)稱為誘導(dǎo)，通過誘導(dǎo)可以確定沙門菌的血清型。近年來，本實(shí)驗(yàn)室將簡(jiǎn)易平板誘導(dǎo)法應(yīng)用到，從業(yè)人員腸道沙門菌檢測(cè)工作中。在實(shí)際工作中體會(huì)到，有些沙門菌經(jīng)多次誘導(dǎo)才能得出血清型，為了提高簡(jiǎn)易平板法一次誘導(dǎo)成功率，總結(jié)出以下幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：自腸道體檢標(biāo)本中分離出的菌株，應(yīng)立即進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，不能及時(shí)誘導(dǎo)的菌株，應(yīng)暫放溫箱保存，不可放入冰箱，低溫易導(dǎo)致沙門菌鞭毛丟失；誘導(dǎo)平板應(yīng)新鮮配制，這樣的誘導(dǎo)平板水分含量充足，有利于沙門菌鞭毛運(yùn)動(dòng)；診斷血清滴加量，不宜過多，否則沙門菌受抑制，不易生長(zhǎng)。經(jīng)過實(shí)踐后，一次誘導(dǎo)成功率得到了提高。由于簡(jiǎn)易平板法類似于血清學(xué)單向免疫擴(kuò)散法，血清和菌量的比例難以把握，因此有的菌株還是得幾次誘導(dǎo)才能確定血清型。

摸索影響因素過程中，查閱相關(guān)文獻(xiàn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，無論是小倒管法、小玻管法，還是簡(jiǎn)易平板法位相變異試驗(yàn)，都存在幾次誘導(dǎo)才能最終鑒定出沙門菌血清型的情況，并推薦了其他實(shí)踐方法，如血平板-濾紙條搭橋誘導(dǎo)法、M肉湯培養(yǎng)法等[10-13]。由于盲樣考核均是有時(shí)間限定的，提示著應(yīng)運(yùn)用快捷、簡(jiǎn)便的誘導(dǎo)方法得出準(zhǔn)確結(jié)果。便采用簡(jiǎn)易平板法，作為參考方法，同時(shí)運(yùn)用傳代與簡(jiǎn)易平板法相結(jié)合的方法，以及血平板-濾紙條搭橋法進(jìn)行沙門菌血清型鑒定。血平板-濾紙條搭橋法是切實(shí)可行的方法，首次運(yùn)用，便取得成功，給予啟示，應(yīng)善于發(fā)現(xiàn)工作難點(diǎn)，積極努力尋求解決方法作為動(dòng)力，更新知識(shí)儲(chǔ)備，拓寬工作思路，了解工作創(chuàng)新及前沿技術(shù)，可有效地促進(jìn)提高實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)水平，也有利于盲樣考核檢測(cè)工作的順利完成。

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R446.5，R378.2+2

A

1674-1129(2017)05-0690-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.017

2017-01-17；

2017-08-07)