葉 榮

（湖北省十堰市鄖西縣疾控中心，湖北 十堰 442000）

1 實(shí)驗(yàn)

我們隨機(jī)抽取50個(gè)切片樣本，請(qǐng)醫(yī)學(xué)中心病理科專科醫(yī)師再次檢查子宮頸切片檢體。從子宮頸剝落上皮細(xì)胞檢體中偵測(cè)人類乳突狀病毒感染。以Nest-PCR偵測(cè)高危險(xiǎn)性及低危險(xiǎn)性人類乳突狀病毒感染(HPV)檢體及DNA萃取:

以子宮頸拭樣棉棒取得子宮頸剝落上皮細(xì)胞后，將子宮頸拭樣棉棒先浸潤(rùn)在5ml(PBS)緩沖液。然后，以酚－氯仿萃取檢體DNA。首先，將含有子宮頸剝落上皮細(xì)胞的緩沖液加以攪拌以釋出細(xì)胞，在室溫下離心1500rpm15分鐘，取細(xì)胞沉淀后加入500ul細(xì)胞溶解液(10mMTris-HCl,150mMNaCl,and10mMEDTA)至于室溫下約5分鐘。接著，加入500ul酚－氯仿，于室溫下離心1500rpm15分鐘，倒掉上清液，然后以絕對(duì)(100%)酒精將DNA沉淀真空抽干后溶于無菌水中[2]。

2 Nest-PCR

為了確保萃取足夠的DNA樣本，實(shí)驗(yàn)中將β-globin 172bp片段擴(kuò)大當(dāng)作internalcontrol。β-globin primer是：5’-ACACAACTGTGTTCACTACC-3’及5’-TCTATTGGTCTGGTTAAA CC-3’[3]。接著，將確定萃取足夠DNA的每個(gè)DNA樣本置入含有10mMTris-HCl(PH=8.3),1.5mMMgCl2,10μggelatin,250μMdNTP,1.2 5UTaqDNApolymerase(Promega)及30pmoleprimers的50μl reactionmixture中。PCR的條件為：首先以95C持續(xù)3分鐘以使雙股DNA分開，接著設(shè)立條件在94C，15秒，42C，2分鐘，72C，20秒，72C，7分鐘，35個(gè)循環(huán)。此步驟共重復(fù)3次，直到這些樣本無法再被擴(kuò)大(amplified)為止。所有的PCR產(chǎn)物以3%的agarosegel進(jìn)行電泳后，將gel予ethidiumbromide染色后在ultra-violettranslluminator下分析結(jié)果。為預(yù)防樣本被污染或有PCR殘留物，實(shí)驗(yàn)前需將實(shí)驗(yàn)用具予以滅菌及避免重復(fù)使用舊吸管。此外，每次進(jìn)行PCR時(shí)都應(yīng)包含有positivecontrol及negativecontrol。

3 結(jié) 果

皮細(xì)胞，以偵測(cè)有無人類乳突狀病毒感染的個(gè)案后，共有137位子宮頸抹片檢查結(jié)果為≥CIN1的潛在性陽性個(gè)案參與此部分的研究。137位潛在性陽性個(gè)案中有43位未接受切片追蹤，有94位個(gè)案接受切片追蹤。接受切片追蹤的94位個(gè)案平均年齡(±SD)為46.2(±13.2)歲，未接受切片追蹤的43位個(gè)案平均年齡(±SD)為43.6(±10.8)歲，二組間的平均年齡并無統(tǒng)計(jì)上的差異。接受切片檢查的個(gè)案中，有3位切片結(jié)果為正常，32位切片結(jié)果為發(fā)炎反應(yīng)，26位為CIN1，12位為CIN2，及21位為≥CIN3。最后，將172位子宮頸抹片檢查結(jié)果為正常的對(duì)照組與3位切片結(jié)果為正常的個(gè)案合并為本研究的健康對(duì)照組。以Fisher’sexacttest檢測(cè)結(jié)果，在健康對(duì)照組、子宮頸發(fā)炎反應(yīng)、CIN1、CIN2、及≥CIN3個(gè)案中，其抽煙狀態(tài)、子宮頸抹片檢查次書、性伴侶人數(shù)皆有顯著的差異。而家屬是否曾患子宮頸癌，在各組間有些微的差異，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)上的差異。其他社會(huì)人口學(xué)變項(xiàng)在各組間則無統(tǒng)計(jì)上的差異。

4 總 結(jié)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高危險(xiǎn)性人類乳突狀病毒感染率在正常對(duì)照組只有11%，在子宮頸發(fā)炎反應(yīng)個(gè)案中有72%個(gè)案感染高危險(xiǎn)性人類乳突狀病毒，而CIN1、CIN2、及≥CIN3個(gè)案中，其高危險(xiǎn)性人類乳突狀病毒的感染率則逐漸增加為81%，84%，及90%。以健康對(duì)照組為基準(zhǔn)，在控制抽煙狀態(tài)、子宮頸抹片檢查次數(shù)、性伴侶人數(shù)及家屬是否曾患子宮頸癌等干擾因素后發(fā)現(xiàn)，子宮頸發(fā)炎個(gè)案有19.3倍(95%信賴區(qū)間=7.6-48.9)的危險(xiǎn)性會(huì)感染高危險(xiǎn)性人類乳突狀病毒，CIN1、CIN2、及≥CIN3患者，則分別有32.2倍(95%信賴區(qū)間=10.4-99.5)、37.2倍(95%信賴區(qū)間=7.4-187.6)、及68.3倍(95%信賴區(qū)間=14.1-328.5)的危險(xiǎn)性會(huì)感染高危險(xiǎn)性人類乳突狀病毒。以nested-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢驗(yàn)個(gè)案有無感染高危險(xiǎn)性或低危險(xiǎn)性人類乳突狀病毒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果，亦有相似的趨勢(shì)。

[1] 涂志華.液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合人乳頭瘤病毒檢測(cè)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2014,12(17):52, 54.

[2] 李風(fēng)艷.高危型人乳頭瘤病毒載量與宮頸癌前病變及宮頸癌的相關(guān)性分析[J].中國(guó)婦幼保健. 2017(16):489-491.

[3] 李艷芳.宮頸癌患者人乳頭瘤病毒與巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒Ⅱ型感染的相關(guān)性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2017(16):3757-3761.