張俊華，常浩，牟明，李云鵬，周瑩瑩

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市阿城區(qū)種子服務中心，哈爾濱 150399）

黑龍江省水稻紋枯病菌菌絲融合群判定及遺傳多樣性分析

張俊華1，常浩1，牟明1，李云鵬1，周瑩瑩2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市阿城區(qū)種子服務中心，哈爾濱 150399）

從黑龍江省27個縣市采集分離到77個水稻紋枯病菌菌株，經(jīng)顯微鏡觀察全部為多核菌株。利用載玻片定位融合法，將分離純化得到的77個菌株分別與AG1-1A、AG1-1C、AG3、AG5、AG-6和AG-8等6個標準菌株作對峙試驗。結果表明，黑龍江省水稻紋枯病菌主要菌絲融合群為AG1-1A、AG1-1C和AG-5，出現(xiàn)頻率分別是80.51%、12.99%、2.60%。營養(yǎng)親合群判別結果表明，77個待測菌株分為23個營養(yǎng)親和群，其中有11個親和群由單個菌株獨立組成，出現(xiàn)頻率為47.83%。遺傳變異分析中，當遺傳距離為0.6667時，從不同菌絲融合群中選取的15個代表菌株可劃分為5個類群，與菌絲融合群判定結果基本一致。

水稻紋枯??；立枯絲核菌；菌絲融合群；營養(yǎng)親和群；SSR

水稻紋枯病為水稻生產(chǎn)普遍存在的三大主要病害之一[1]，近年來，隨氮肥使用量增加和水稻單一品種大面積推廣，該病在我國水稻種植區(qū)大面積暴發(fā)，高產(chǎn)稻區(qū)危害更突出。黑龍江省為我國北方主要水稻高產(chǎn)種植區(qū)，近20年來水稻紋枯病發(fā)病面積和發(fā)病程度逐年增加，田間調(diào)查結果表明，各水稻種植區(qū)主栽品種均不同程度感病，產(chǎn)量損失達20%～30%，嚴重可達50%，重病地塊，病害危害程度擴展至劍葉，植株成片倒伏，空秕率增高，水稻嚴重減產(chǎn)[2]。

引起水稻紋枯病病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani kühn）[3]，屬無性菌類真菌。該病原菌在自然條件下一般為無性世代[4]。此類真菌在無性階段不產(chǎn)生任何孢子，培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和致病性等易變異，種間或種內(nèi)鑒定困難。為系統(tǒng)研究絲核菌種群分類和遺傳類型，1969年Parmeter首次建立4個菌絲融合群[5]，1984年Ogoshi將雙核絲核菌分為15個菌絲融合群（AGA～AGO）[6]。目前立枯絲核菌菌絲融合群主要有14個（AG1～AG13，AGBI）[7]，融合亞群數(shù)量增加，AG-1融合群被劃分為4個融合亞群：AG1-IA、AG1-IB、AG1-IC、AG1-ID。從菌絲融合群主要分布范圍看，世界范圍內(nèi)分布有AG1～AG4。日本主要分布AG1～AG7和AGBI；中國分布AG1～AG 8；以色列主要分布有AG 6；澳大利亞主要分布有AG8[8]。20世紀90年代以來，我國學者研究立枯絲核菌菌絲融合結果表明，廣西、四川、遼寧、湖北、江蘇等地區(qū)玉米和水稻立枯絲核菌優(yōu)勢融合群類型為AG1-1A[9-14]，四川地區(qū)棉花立枯絲核菌優(yōu)勢菌絲融合群類型為AG-4[15]，湖北省和江蘇省小麥紋枯病病原菌除禾谷絲核菌外，立枯絲核菌也是其重要病原菌，融合群類型為AG-2和AG-5[16-17]。目前關于黑龍江省水稻紋枯病菌絲融合群分布情況尚無系統(tǒng)研究，黑龍江省水稻紋枯病菌菌絲融合群分布規(guī)律亟待分析。

目前Rhizoctonia solani最主要分類手段是菌絲融合群分類法，但存在局限性。主要表現(xiàn)：①菌絲融合群分類界限不清楚，某些被測菌株依靠目前國際已有菌絲融合群標準菌株無法完全區(qū)分，出現(xiàn)類似AG-BI菌株可與多個融合群發(fā)生融合[18]；②各菌絲融合群內(nèi)部或各菌絲融合群間進化關系復雜，存在偏差。隨分子標記技術發(fā)展，基于聚合酶鏈式反應簡單重復序列（SSR）分子標記技術成為研究病原菌群體遺傳多樣性方法之一[19]。王玲等利用SSR分子標記技術手段分析中國南方八省水稻紋枯病菌群體遺傳結構[20]，劉翔等利用SSR分子標記分析湖南桃江病圃麗江新團黑谷稻瘟病菌傳多樣性[21]。本試驗采用SSR分子標記從DNA水平研究黑龍江省水稻紋枯病菌種內(nèi)遺傳情況，與傳統(tǒng)菌絲融合分類手段相互結合印證，以期了解黑龍江省水稻紋枯病菌菌絲融合群類型，為黑龍江省水稻紋枯病病害流行規(guī)律檢測和抗病品種選育提供基礎理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2014 、2015年7 ～9月采集黑龍江省27個縣市（虎林、方正、五常、雞西、海林、尚志、慶安、密山、牡丹江、五大連池、寶清、七臺河等）水稻紋枯病典型病株的菌核和病組織，經(jīng)分離純化得到77個菌株，根據(jù)采集地點編號，4℃保存于PDA培養(yǎng)基備用。

標準菌株包括：AG1-1A、AG1-1C、AG-3、AG-5、AG-6、AG-8共6個標準菌株，由中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲融合群判定方法

采用載玻片定位融合法[22]判定菌絲融合群，參考陳延熙等玻片配對法[23]。將菌株純化后在4℃條件下保存于PDA培養(yǎng)基，菌株兩兩一組分別觀察菌絲融合。具體試驗操作方法如下：于28℃下培養(yǎng)待測菌株及標準菌株48 h后，在各菌株菌落邊緣打取直徑為5 mm菌絲塊，在超凈工作臺內(nèi)，挑取一個標準菌株菌絲塊置于載玻片中央，兩側(cè)各放同一待測或者不同待測菌株菌絲塊，菌絲塊間隔2 cm。將接菌后載玻片放在無菌培養(yǎng)皿中并注入少量無菌水保濕，28℃下培養(yǎng)16～20 h，待兩菌落前緣菌絲尖端在玻片中央交疊約2 cm時，取出玻片，鏡檢[24-25]。根據(jù)待測菌株與某一標準菌株間的菌絲融合程度判定其融合群種類。

1.2.2 營養(yǎng)親和群判別方法

表1 黑龍江省水稻紋枯病菌分離菌株及其采集地點Table 1R.solani strains from Heilongjiang Province and collection sites

采用對峙培養(yǎng)法判別菌株營養(yǎng)親和群，28℃下將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，隨機選取7個不同供試菌株按2、3、2排列，分別轉(zhuǎn)于PDA平板培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)使其相互對峙生長15～20 h后觀察。根據(jù)兩菌株間菌絲交匯處是否產(chǎn)生分離帶為依據(jù)判斷營養(yǎng)親和群類型[26]，無分離帶為同一營養(yǎng)親和群，有分離帶為不同營養(yǎng)親和群。難以判斷菌株，參照菌絲融合群判定的載玻片配對法，與已分群菌株融合性觀察判別[27-28]，在融合性觀察中，若兩菌株間表現(xiàn)為完全融合，則該菌株與已分群菌株親和，為同一親和群；若兩菌株間表現(xiàn)為不完全融合，則該菌株與已分群菌株不親和，屬不同親和群。

1.2.3 遺傳多樣性分析

在菌絲融合群判定基礎上，從AG1-1A融合群隨機選取5個菌株（WC001、HL001、FZ001、SZ001、LK001），從AG1-1C融合群也隨機選取5個菌株（MS001、HL003、HC001、BQ002、BL001），并選取AG-5包含的2個菌株（FZ002和FZ003）及無法判別的3個菌株（WC002、WC003和ZY003），共計15個供試菌株。將15個供試菌株在PDA平板培養(yǎng)基上活化后，在每個菌株菌落邊緣取直徑5 mm菌碟轉(zhuǎn)移到PD液體培養(yǎng)基中。28℃、100 r·min-1培養(yǎng)3 d。收集菌絲體后用無菌蒸餾水沖洗干凈后過濾，干燥。參照劉麗等提出CTAB法提取供試菌株DNA[29]。

25μL PCR反應體系，DNA模板2 μL（100 ng·μL-1）、10×PCR buffer（15 mmol·L-1MgCl2）2.5 μL、引物各0.6 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）0.2 μL、10×Easy Taq buffer（1 U·μL-1）0.3 μL、ddH2O 18.8 μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min、94℃變性30 s、54～60℃退火30 s、72℃延伸30 s、循環(huán)次數(shù)35 cycles、72℃延伸10 min、4℃終止反應并保存。擴增產(chǎn)物加等量上樣緩沖液94℃變性處理10 min，4%變性聚丙稀酰胺80 W恒功率電泳1.5 h，銀染顯色。

引物參考溫娜娜[30]分析水稻紋枯病菌遺傳多樣性所用標記引物序列（由上海生工生物技術工程技術服務有限公司合成。）TC01（F：CATGCTCATTTG CGACATCT R：AACAACAGCAAGGGCCATC）；TC02（F：GATGGCCCTTGCTGTTGTT R：CGTTTACGCA TTCTGGCTTT；TC03（F：CTCATTTGCGACATTTG AG R：TACCCATTCTGGCTTTTTGC）；TC05（F：TG TCCAACAAGACAGTTCG R：AACCGAGCCCTTAG CTCTTC）；TC06（F：CAGAGATACGTCCAGCAAC G R：ATGCTCATTTGCGACATCTG）；TC07（F：AG AATGAGATGCGGAATGTG R：TCTTGGGCTAACT CTTGTTGG）；TC10（F：AGCCTCATCAGATATGAC GTGA R：TTGGGGTTGTTGATACTGAGG）；TC11（F：TGCAGAACCATAGGACTGG R：TGACAGACA GGACAGCTACTGG）；TC12（F：CCACACAGTGGC TAAAACCTC R：CACCTTGTTCGCTTTATTGG）；TC13（F：AACGCATCGACTTCTGGTTC R：GAGTC CCGTAAACCCATTTG）；對擴增的15個菌株，選取條帶清晰，多態(tài)性好引物分析，以“0”和“1”分別記錄擴增條帶有無，將穩(wěn)定且易于辨認多態(tài)性條帶記為“1”；無多態(tài)性條帶，空缺時記錄為“0”，統(tǒng)計時如遇到少數(shù)不能重復條帶則忽略不計。計算任意兩個菌株相似系數(shù)（GS：GS=2Nij（Ni+ Nj），其中，Ni和Nj分別為i和j兩個菌株總等位基因數(shù)，Nij為i和j兩菌株共有等位基因數(shù)。遺傳距離（GD）=1-GS，利用GD值按非加權組平均法（UPGMA），AGROSYS統(tǒng)計分析軟件聚類分析。

2 結果與分析

2.1 菌株分離和鑒定

水稻紋枯病菌主要特征為：菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落特征一致，圓形并呈輻射狀生長，無性階段不產(chǎn)生任何孢子，多核，初期菌絲體無色，后期形成均質(zhì)菌核，菌絲體呈不同深淺褐色，菌絲寬6.2～ 12.1 μm，菌絲分枝呈直角，分枝有隔膜形成。

圖1 水稻紋枯病菌主要特征Fig.1Main characteristics of R.solani causing rice sheath blight

2.2 菌絲融合群判定結果

77個供試菌株經(jīng)融合群判定結果表明（見表2），黑龍江省水稻紋枯病菌菌絲融合群是AG1-1A、AG1-1C、AG-5，優(yōu)勢融合群是AGI-IA，包含62個菌株，占全部菌株80.51%，廣泛分布于所有病樣采集地區(qū)。其中AGI-IC融合群包含10個菌株，占全部菌株12.99%，主要分布在樺川、依安、密山、寶清和勃利等地區(qū)。AG-5融合群包含2個菌株，占全部菌株2.60%，主要分布在方正縣。還有3個菌株無法與所有標準菌株融合，無法判斷其所屬菌絲融合群，主要分布在五常和肇源地區(qū)，占全部菌株3.90%。說明黑龍江水稻紋枯病菌菌絲融合群存在分化現(xiàn)象，各地區(qū)分離得到菌株數(shù)目不一，但水稻紋枯病菌絲融合群類型均以AG1-1A為主。

表2 菌絲融合群出現(xiàn)頻率及分布地區(qū)Table 2Frequencies and distribution area of AG of Rhizoctonia solani

2.3 營養(yǎng)親和群判別結果

營養(yǎng)親和群研究表明，77個供試菌株共分為23個營養(yǎng)親和群（見表3）。

由表3可知，其中有11個菌株獨立成群，占總體47.83%。菌株數(shù)最多親和群共含有15個菌株，主要分布在鐵力、慶安、方正、五常、綏化等地，占總體19.48%，其次是含有14個菌株營養(yǎng)親和群，主要分布五常、方正、密山、寶清、寧安等地，占總數(shù)18.18%。還有來自雞東、虎林、樺川等地9個菌株及來自雞東、尚志、樺川、慶安、城高子鎮(zhèn)等地8個菌株各為1個營養(yǎng)親和群，分別占總數(shù)11.67%和10.39%。有2個營養(yǎng)親和群，每個親和群包含4個菌株，占總數(shù)5.19%。還有6個營養(yǎng)親和群，每個包含2個菌株，占總數(shù)2.60%。說明黑龍江省水稻紋枯病菌營養(yǎng)親和群與病原菌采集地點相關性較小，原因可能是由于各采集地種植品種不同，自然環(huán)境多變，積溫不一，病原菌遺傳產(chǎn)生變異。

表3 營養(yǎng)親和群判定結果及出現(xiàn)頻率Table 3Determination results and frequency on VCG of R.solani

續(xù)表

2.4 黑龍江省水稻紋枯病菌遺傳多樣性分析

選取10對SSR引物對來自不同菌絲融合群15個供試菌株擴增，其中6對引物（TC0l、TC02、TC03、TC06、TC10、TC13）可對供試菌株擴增出清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性良好條帶。每對引物擴增條帶均在3～10條，共得到49條譜帶，多分布在150～ 550 bp，平均每條引物擴增出8.17條譜帶。其中多態(tài)性條帶31條，占總數(shù)77.5%。

引物TC06多態(tài)性最好，多態(tài)性條帶比率為85.7%，TC10多態(tài)性較差，多態(tài)性條帶比率為66.6%。15個供試菌株遺傳差異明顯，WC002和其他14個供試菌株之間遺傳距離為1，表明WC002與其他菌株之間親緣關系較遠，HL003和MS001及HC001遺傳背景極為相似，遺傳距離0.25，但這兩個菌株在地域分布上無關，HC001來自樺川縣，而HL001來自虎林，MS001來自密山。AG-5融合群包含兩個菌株，F(xiàn)Z002和FZ003遺傳距離為0.25，來自同一采集地點方正縣。WC002和WC003均采自五常市，但兩菌株親緣關系較遠，遺傳距離為1。說明黑龍江省水稻紋枯病菌遺傳分化與病原菌采集地點無相關性，病原菌遺傳類型復雜。

圖2 部分引物對供試菌株擴增結果Fig.2Amplification products of part primers for Rhizoctonia isolates

表4 15個代表菌株SSR遺傳距離Table 4Genetic distance of 15 representative Rhizoctonia isolates

圖3 15個代表菌株SSR遺傳距離聚類分析Fig.3Genetic distance cluster analysis of 15 representative Rhizoctonia isolates by SSR

聚類分析結果表明當遺傳距離為0.6667時，15個菌株劃分為5個類群，其中第Ⅱ類群包括5個菌株，全部來自AG1-1A融合群，第Ⅳ類群包括5個菌株，均來自AG1-1C融合群，第Ⅲ類群包括兩個菌株，均來自AG-5融合群。利用菌絲融合群手段無法判別3個待測菌株WC002、WC003、ZY003，其中WC003、ZY003屬于Ⅴ類型，說明WC003、ZY003可屬同一菌絲融合群。WC002屬于Ⅰ類型。聚類分析結果與菌絲融合群判定結果一致，表明SSR遺傳多樣性分析方法可用于菌絲融合群判定。

3 討論

水稻紋枯病為我國各稻區(qū)水稻主要病害之一，由于水稻種植品種單一性和栽培技術變化，水稻紋枯病菌遺傳變異頻繁，紋枯病危害嚴重[31]。研究水稻紋枯病菌菌絲融合群分布情況可為水稻紋枯病抗病育種和病害防治提供理論依據(jù)。鄧先明等鑒定四川省水稻紋枯病樣菌絲融合群，結果表明，四川省水稻紋枯病主要菌絲融合群為AG1群[32]。李祥等判定湖北省44個縣市水稻紋枯病菌菌絲融合群，結果表明，湖北省水稻紋枯病主要菌絲融合群為AG1-1A[33]。本試驗利用載破片定位融合法采集黑龍江省27個縣市77個菌株判定菌絲融合群，結果表明，黑龍江省水稻紋枯病菌主要融合群類型為AG1-1A、AG1-1C和AG-5，優(yōu)勢融合群為AG1-1A。綜合各地區(qū)水稻紋枯病研究可知，我國各地區(qū)水稻紋枯病菌主要融合群為AG1-1A，其他引起水稻紋枯病融合群因地理位置和環(huán)境條件不同而存在差異。AG-5融合群一直被認為來自豆科、玉米和土壤，本試驗首次發(fā)現(xiàn)AG-5融合群也可侵染水稻，并引起水稻紋枯病癥狀。本試驗另有3個菌株與所選標準菌株均不融合，其原因可能是本試驗僅選用6株標準菌株，無法排除黑龍江省水稻紋枯病菌存在其他融合群可能，有待后期研究。

SSR分子標記技術與RAPD、AFLP、ISSR等技術相比，具有多態(tài)性高、操作簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，在病原菌遺傳多樣性研究中應用廣泛[34-38]。本研究利用SSR分子標記技術研究我國黑龍江省水稻紋枯病菌不同融合群菌株間遺傳多樣性。結果顯示15個供試菌株在遺傳距離為0.6667時劃分為5個類群，與菌絲融合鑒定結果基本一致，可驗證本試驗結果準確性。同時，SSR聚類結果表明同一融合群內(nèi)菌株遺傳距離與采集地點無明顯相關性，不同菌絲融合群代表菌株存在遺傳多樣性。

4 結論

本試驗利用載玻片定位融合法判定77個待測菌株菌絲融合群，結果表明，黑龍江省水稻紋枯病菌主要菌絲融合群是AG1-1A、AG1-1C和AG-5，營養(yǎng)親和群判定結果和菌株采集地點無直接相關性，77個待測菌株共分為23個營養(yǎng)親和群，SSR分子標記研究表明，來自不同菌絲融合群15個供試菌株在遺傳距離為0.6667時共分為5個種群，與菌絲融合群判定結果一致。

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Determination of anastomosis group onRhizoctonia solanicausing rice sheath blight and genetic diversity analysis in Heilongjiang Province

Z HANG Junhua1,CHANG Hao1,MU Ming1,LI Yunpeng1,ZHOU Yingying2(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Crop Seed Service Center of Acheng District in Harbin,Harbin 150399,China)

A total of 77Rhizoctonia solanistrains causing rice sheath blight were collected from 27 counties in Heilongjiang Province,77 strainsby using microscope,and the results indicated that all the strainswere multinuclear.The 77 isolates were further tested by using the method of slide positioning fusion with six standard strains,including AG1-1A,AG1-1C,AG3,AG5,AG-6,and AG-8.The results showed that theRhizoctonia solani causing rice sheath blight in Heilongjiang Province were mainly in AG1-1A,AG1-1C and AG-5 fusion group,accounting for 80.51%,12.99%,2.60%,respectively.Vegetative compatibility results showed that 77 tested isolates were classified into the 23 vegetative compatibility groups,among which 11 groups were composed of a single strain,accounting for 47.83%.In theanalysisofgeneticvariation,whenthegeneticdistancewas0.6667,the15representative strains selected from different groups were divided into five groups,and the results were consistent with the results of the fusion group.

S482.2+99

A

1005-9369（2017）02-0020-09

2016-12-01

哈爾濱市應用技術研究與開發(fā)項目（2014AB6BN036）；高等學校創(chuàng)新能力提升計劃（即“2011計劃”）資助項目；中央引導地方科技發(fā)展專項資助項目（ZY16C06）

張俊華（1973-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為寄主與病原物互作。E-mail:podozjh@163.com

張俊華,常浩,牟明,等.黑龍江省水稻紋枯病菌菌絲融合群判定及遺傳多樣性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,48(2):20-28.

Zhang Junhua,Chang Hao,Mu Ming,et al.Determination of anastomosis group onRhizoctonia solanicausing rice sheath blight and genetic diversity analysis in Heilongjiang Province[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(2):20-28.(in Chinese with English abstract)

時間2017-3-7 16:12:37[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170307.1612.004.html