孟祥奇 梁國(guó)強(qiáng) 尢君怡 馬奇翰
(江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科,江蘇 蘇州 215003)
實(shí) 驗(yàn) 研 究
化痰除濕祛瘀劑膝痹康對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞凋亡調(diào)控基因表達(dá)的影響※
孟祥奇 梁國(guó)強(qiáng)1尢君怡 馬奇翰△
(江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科,江蘇 蘇州 215003)
目的 研究化痰除濕祛瘀劑膝痹康對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎( osteoarthritis,OA)軟骨細(xì)胞調(diào)控基因表達(dá)的影響。方法 取全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)膝骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織,采用酶消化培養(yǎng)法培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞,采用甲苯胺藍(lán)染色鑒定細(xì)胞來(lái)源。將軟骨細(xì)胞分為對(duì)照組、膝痹康0.016、0.08、0.4、2.0、10.0 mg/mL組,培養(yǎng)24 h后,應(yīng)用甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。根據(jù)增殖結(jié)果將軟骨細(xì)胞分為對(duì)照組、膝痹康低、中、高劑量組(0.05、0.1、2.0 mg/mL),用TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2、Bcl-2同源水溶性相關(guān)蛋白X(Bax)及p53 mRNA表達(dá)。結(jié)果 本研究成功建立了人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞有限細(xì)胞系,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好;甲苯胺藍(lán)染色證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為來(lái)自中胚層的軟骨細(xì)胞。膝痹康在0.016~10.0 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)OA軟骨細(xì)胞波長(zhǎng)=450 nm處24 h的光密度(OD)有影響。與對(duì)照組相比,膝痹康低劑量組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化(P>0.05),膝痹康中、高劑量組下降(P<0.05,P<0.01)。膝痹康低、中、高劑量組間比較顯示,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比,膝痹康低劑量組Bcl-2、Bax及p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化(P>0.05),膝痹康中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05),Bax及p53 mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01);與膝痹康低劑量組相比,膝痹康中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05),Bax及p53 mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01);與膝痹康中劑量組相比,膝痹康高劑量組Bax mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 化痰除濕祛瘀劑膝痹康調(diào)控細(xì)胞凋亡基因的表達(dá),抑制軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡,這可能是抑制軟骨破壞的重要機(jī)制之一。
骨關(guān)節(jié)炎;化痰;細(xì)胞凋亡;bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì);基因,bcl-2;基因,p53
近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎( osteoarthritis,OA)患者的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)研究,從新鮮分離的軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞凋亡(apoptosis)的現(xiàn)象,并且軟骨細(xì)胞凋亡的數(shù)量與OA的病程、病變程度具有高度一致性[1-2]。由此,本研究以國(guó)內(nèi)外有關(guān)中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎與軟骨細(xì)胞凋亡研究的進(jìn)展為思路,根據(jù)中醫(yī)骨傷科治療膝骨關(guān)節(jié)炎的豐富理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),在前期臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,觀察不同濃度的化痰除濕祛瘀劑“膝痹康”(由制天南星、制川烏、薏苡仁、刺五加、丹參、地龍組成,由《太平惠民和劑局方》之小活絡(luò)丹化裁而來(lái))對(duì)體外培養(yǎng)的膝骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)透明軟骨細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、與Bcl-2同源水溶性相關(guān)蛋白X(Bcl-2-Associated X,Bax)和p53 mRNA表達(dá)的影響,為進(jìn)一步探討中醫(yī)化痰除濕祛瘀法防治膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞(標(biāo)本來(lái)源) OA軟骨標(biāo)本均取自在江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科人工膝關(guān)節(jié)置換的原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎患者,收集截骨塊。膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)制訂的膝骨關(guān)節(jié)炎分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[3]以及經(jīng)典Kellgren 和Lawrence 骨關(guān)節(jié)炎放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。以上標(biāo)本的取材均先告知患者并征得同意。
1.1.2 藥物與試劑 中藥飲片:制天南星、制川烏、薏苡仁、刺五加、丹參、地龍中藥飲片,蘇州市春暉堂飲片廠;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶(美國(guó)GIBCO公司);胰蛋白酶、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium method,MTT)(美國(guó)Sigma公司);甲苯胺藍(lán)染色液(南京森貝伽生物科技有限公司);細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling,TUNEL)法檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);總RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)一抗:Ⅱ型膠原抗體,(英國(guó)Abcam公司);二抗:羊抗兔FITC-IgG,(美國(guó)Santa Cruz公司);引物合成為美國(guó)Invitrogen公司之上海貿(mào)易有限公司合成。其他試劑均為市售分析純。
1.1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)科峻儀器公司);M2酶標(biāo)儀(Benchmark公司);蔡司倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司);實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);核酸蛋白分析儀(美國(guó)Beckman公司);高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司)。
1.2 方法
1.2.1 藥物制備 膝痹康藥物組成:制天南星12 g,制川烏6 g,薏苡仁10 g,刺五加20 g,丹參10 g,地龍10 g。按組方劑量配比嚴(yán)格稱取飲片,加75%乙醇,回流提取2次,第1次加醇8倍量,回流2 h;第2次加醇6倍量,回流1.5 h;濾過(guò),合并濾液,回收乙醇至盡,清膏備用。藥渣加水煎煮2次,第1次加水8倍量,煎煮2 h;第2次加水6倍量,煎煮1 h,濾過(guò),合并濾液,減壓濃縮至相對(duì)密度1.07~1.08(40~50 ℃)的清膏,與醇提清膏混勻,冷凍干燥制備成相當(dāng)于2.0 g生藥/g的粉末,-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩8鶕?jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.2.2 人膝OA軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定 人膝OA軟骨細(xì)胞的分離參考文獻(xiàn)[5-7]釆用Ⅱ型膠原酶一步消化法,按甲苯胺藍(lán)染色法進(jìn)行鑒定,軟骨細(xì)胞爬片48 h,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗,4%中性甲醛固定30 min,用1%甲苯胺藍(lán)染色30 min,迅速用無(wú)水乙醇漂洗1次,空氣干燥,鏡下觀察。
1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取上述第3代人膝OA軟骨細(xì)胞,用含10%胎牛血清的高糖DMEM計(jì)數(shù)調(diào)整為5×104個(gè)/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中( 200 μL/well),置于37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁后。根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)分別設(shè)計(jì)為:膝痹康0.016、0.08、0.4、2.0、10.0 mg/mL 5個(gè)劑量組及未加藥物組(對(duì)照組),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,作用時(shí)間分別為24 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,各藥物濃度組細(xì)胞活力(%)=[(加藥細(xì)胞OD-對(duì)照細(xì)胞OD)/對(duì)照細(xì)胞OD]×100%(OD表示光密度)。反映出細(xì)胞數(shù)量及代謝水平。
1.2.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 另取上述第3代人膝OA軟骨細(xì)胞,按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種軟骨細(xì)胞于6孔板中,置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄原培養(yǎng)液,PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次,將0.5、1.0、2.0 mg/mL梯度濃度的膝痹康藥液分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)孔中(2 L/well),分別設(shè)為膝痹康低、中、高劑量組,另設(shè)未加入藥物的孔板為對(duì)照組,作用24 h后,PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min;PBS緩沖液洗滌3次,每次5 min。加入含0.1% Triton X-100的PBS,冰浴孵育2 min。用PBS緩沖液洗滌2次。按照試劑盒說(shuō)明配制適當(dāng)量的TUNEL檢測(cè)液,充分混勻。在樣品上加50 μL TUNEL檢測(cè)液,37 ℃避光孵育60 min。PBS緩沖液洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察[細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè),可以發(fā)現(xiàn)180~200 bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時(shí),暴露的3′-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynuc Leotidyl Transferase,TdT)的催化下加上綠色熒光探針熒光素(FITC)標(biāo)記的d UTP(fluorescein-d UTP),從而可以通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)綠色熒光表達(dá)凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)]。使用200倍放大倒置熒光顯微鏡觀察并隨機(jī)選取視野拍照,選取有代表性的圖片,計(jì)數(shù)5~7 張圖片的凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù),計(jì)算每個(gè)視野下TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率。
1.2.5 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡基因 另取上述第3代人膝OA軟骨細(xì)胞,按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)液,PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次,根據(jù)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將0.5、1.0、2.0 mg/mL梯度濃度的膝痹康藥液分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)孔中(2 L/well),分別設(shè)為膝痹康低、中、高劑量組,另設(shè)未加入藥物的孔板為對(duì)照組,作用24 h。參照說(shuō)明書(shū)提取各組總RNA。在20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中PCR擴(kuò)增成cDNA,50 μL PCR反應(yīng)體系在下列條件下行PCR擴(kuò)增:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延長(zhǎng)1 min,36個(gè)循環(huán)后,72 ℃延長(zhǎng)10 min。其中Bcl-2引物:sense 5′-TGCACCTGACGCCCTTCAC-3′, anti-sense 5′-AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′;Bax引物:sense 5'-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3',anti-sense 5' -GTCCAGCCCATGAGGTTCT-3';p53引物:sence 5′-CCTCACCATCATCACACTGG-3′,anti-sense 5′-GCTCTCGGAACATCTCGAAC-3′。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,25 min)。應(yīng)用凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行攝影并定量分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.1 人膝OA軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色形態(tài)學(xué)觀察到OA軟骨細(xì)胞為梭形、短梭形,具有較強(qiáng)的折光性,胞核為圓形或橢圓形(見(jiàn)圖1), 符合軟骨細(xì)胞的形態(tài)特征。
圖1 人膝OA軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色鑒定結(jié)果
2.2 人膝OA軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)活力檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1、圖2。
表1 人膝OA軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)活力檢測(cè)結(jié)果 ±s
注:a為對(duì)照組,b、c、d、e、f分別為膝痹康0.016、0.08、0.4、2.0、10.0mg/mL
圖2 人膝OA軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)活力檢測(cè)結(jié)果
由表1、圖2可見(jiàn),膝痹康在0.016~10.0mg/mL的濃度范圍對(duì)OA軟骨細(xì)胞在波長(zhǎng)=450nm處24h的OD有影響,在此范圍內(nèi)不同濃度的膝痹康在24h對(duì)OA軟骨細(xì)胞OD無(wú)明顯差異(P>0.05)。
2.3 4組OA軟骨細(xì)胞凋亡率結(jié)果 根據(jù)膝痹康對(duì)OA軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇其在0.4~2.0 mg/mL的范圍內(nèi)設(shè)置0.5、1.0、2.0 mg/mL 3個(gè)劑量,作用24 h進(jìn)行凋亡的實(shí)驗(yàn)研究。OA軟骨細(xì)胞經(jīng)TUNEL 標(biāo)記后的結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。
表2 4組OA軟骨細(xì)胞凋亡率結(jié)果 ±s
與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與膝痹康低劑量組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與膝痹康中劑量組比較,#P<0.05
圖3 4組OA軟骨細(xì)胞凋亡率結(jié)果
由表2、圖3可見(jiàn),與對(duì)照組相比,膝痹康低劑量組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化(P>0.05),膝痹康中、高劑量組下降(P<0.05,P<0.01)。膝痹康低、中、高劑量組間比較顯示,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.4 4組OA軟骨細(xì)胞凋亡基因表達(dá)結(jié)果 見(jiàn)表3、圖4。
表3 4組OA軟骨細(xì)胞凋亡基因表達(dá)結(jié)果 ±s
與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與膝痹康低劑量組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與膝痹康中劑量組比較,#P<0.05
圖4 4組OA軟骨細(xì)胞凋亡基因表達(dá)結(jié)果
由表3、圖4可見(jiàn),與對(duì)照組相比,膝痹康低劑量組Bcl-2、Bax及p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化(P>0.05),膝痹康中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05),Bax及p53 mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01 )。與膝痹康低劑量組相比,膝痹康中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05),Bax及p53 mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01);與膝痹康中劑量組相比,膝痹康高劑量組Bax mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05 )。
膝骨關(guān)節(jié)炎是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎之一,是一種以退行性病理改變?yōu)榛A(chǔ)的疾患[8]。多發(fā)于中老年人群,其癥狀多表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)紅、腫、痛,上下樓梯痛、坐起立行時(shí)膝部痠痛不適等,也會(huì)有患者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、彈響、積液等,如不及時(shí)治療,則會(huì)引起關(guān)節(jié)畸形、殘廢。目前膝骨關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)臨床治療及實(shí)驗(yàn)研究多集中在補(bǔ)益肝腎及活血通絡(luò)兩大方面[9-10]。長(zhǎng)期以來(lái),吳門(mén)醫(yī)派治療本病積累了豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),全國(guó)名老中醫(yī)龔正豐教授認(rèn)為本病雖屬痹證范疇,卻與風(fēng)寒濕痹不盡相同,其成因復(fù)雜,為虛實(shí)夾雜之證,痰、濕、瘀均為重要的致病因素,故論治時(shí)以祛邪為主,并重視化痰祛濕、活血通絡(luò),尤其是對(duì)于辨證屬濕注關(guān)節(jié)或痰瘀交阻者尤為適宜?;党凉耢铕龇ㄊ驱徴S教授臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎的重要方法[11],而利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)手段闡明此法的效用機(jī)制亦為重要。
化痰除濕祛瘀劑“膝痹康”方中天南星藥性燥烈,其辛開(kāi)走竄之力尤強(qiáng),專(zhuān)走經(jīng)絡(luò),善治經(jīng)絡(luò)風(fēng)痰,是治療痰、風(fēng)、結(jié)、腫之良藥,炮制可減輕其毒性,具有燥濕化痰、除經(jīng)絡(luò)中痰濕、止痛的作用;川烏祛風(fēng)除濕,溫經(jīng)通絡(luò),可除寒濕結(jié)聚之濕痰死血,為治療關(guān)節(jié)痹痛之要藥,與天南星配伍可化痰祛風(fēng),通絡(luò)止痛;薏苡仁利水滲濕,兼能健脾,功似茯苓,又能舒筋絡(luò),緩攣急,治療風(fēng)濕痹痛濕邪偏盛者;刺五加補(bǔ)益脾腎,祛風(fēng)除濕,與薏苡仁相配,具有利水滲濕、健脾除痹的作用;丹參活血祛瘀,涼血養(yǎng)血,是平和的活血化瘀良藥,其性微寒,可佐制天南星、川烏燥烈之性;地龍能活血化瘀,祛痰除濕,通剔經(jīng)絡(luò),加強(qiáng)活血化瘀通絡(luò)的作用。諸藥合用,共收化痰除濕、活血通絡(luò)之效。前期臨床試驗(yàn)表明,膝痹康有改善膝骨關(guān)節(jié)炎臨床癥狀的功能,如患者的步行能力、日?;顒?dòng)、疼痛、壓痛、腫脹、活動(dòng)受限、關(guān)節(jié)積液等,未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示,膝痹康可以明顯減輕膝骨關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的病理?yè)p傷,對(duì)軟骨及滑膜退變有較好的延緩作用,并可以通過(guò)抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛等作用以減輕關(guān)節(jié)腫脹和改善疼痛步態(tài);膝痹康可通過(guò)降低血液和關(guān)節(jié)液中炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的水平,以抑制氧自由基及一氧化氮(NO)對(duì)軟骨細(xì)胞及基質(zhì)的破壞作用,達(dá)到延緩軟骨退變的目的[13-14];另外膝痹康可通過(guò)抑制關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織中MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(dá)水平升高而減輕關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解,減緩關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞[15-16]。
近年來(lái),研究顯示OA患者軟骨細(xì)胞有細(xì)胞凋亡(apoptosis)的現(xiàn)象。目前研究發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的各個(gè)階段以及各種組織和細(xì)胞的病理改變中,軟骨細(xì)胞凋亡在OA的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,并且軟骨細(xì)胞凋亡的數(shù)量與OA的病程、病變程度具有高度一致性[17]。凋亡是調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨生長(zhǎng)發(fā)育、控制軟骨細(xì)胞功能狀態(tài)、維持關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定必需的生理性過(guò)程[18-19],多用以清除無(wú)功能、受損害、衰老的細(xì)胞,正常的軟骨細(xì)胞中亦可見(jiàn)凋亡現(xiàn)象,但很少被檢出,一般多存在于軟骨表層[20]。過(guò)度凋亡則是病理性的和有害的,并被認(rèn)為是OA發(fā)病的重要機(jī)制之一。因此,課題組選擇目前認(rèn)可的體外培養(yǎng)的OA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為研究的細(xì)胞模型。細(xì)胞凋亡是由死亡信號(hào)誘發(fā)的受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過(guò)程,是細(xì)胞生理性死亡的普遍形式,是真核細(xì)胞在一定條件下通過(guò)啟動(dòng)其內(nèi)部自身機(jī)制而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡的發(fā)生使特定的細(xì)胞群體在特定的時(shí)間和特定的部位死亡,與細(xì)胞有絲分裂相互協(xié)調(diào)以維持細(xì)胞群體相對(duì)衡定,從而保障細(xì)胞數(shù)量以及形態(tài)和功能的平衡[21]。本研究結(jié)果提示,膝骨關(guān)節(jié)炎患者體外培養(yǎng)的膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡明顯增多,可見(jiàn)其增殖、凋亡的動(dòng)態(tài)平衡被打破。膝痹康中、高劑量與對(duì)照組比較,凋亡率明顯下降,凋亡率與膝痹康的劑量可能成負(fù)性劑量依賴性的關(guān)系。初步證明了膝痹康在一定劑量范圍內(nèi)存在拮抗OA軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡的作用,可能延緩了關(guān)節(jié)軟骨的退變。
細(xì)胞凋亡受基因嚴(yán)密的控制,其中Bcl-2家族在凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用,是目前研究已知的最重要的抑制凋亡因子。Bax和Bcl-2基因有40%的同源性,但它們的作用卻完全相反,是一對(duì)正負(fù)調(diào)節(jié)因子,Bcl-2/Bax的比值與決定細(xì)胞受到刺激信號(hào)后是否存活相關(guān),Bcl-2/Bax比值升高,則抑制細(xì)胞凋亡,反之則促凋亡。研究證實(shí),在細(xì)胞凋亡異常的疾病中存在著B(niǎo)cl-2/Bax比例的異常,即促凋亡因子Bax和凋亡抑制因子Bcl-2兩者失衡[22]。另一方面Bax和p53 mRNA直接相互作用,使Bax多聚化,誘發(fā)各種促凋亡因子的釋放,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。本研究結(jié)果顯示,膝痹康在一定劑量范圍內(nèi)能顯著地上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá),下調(diào)Bax和p53 mRNA的表達(dá),推測(cè)其抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,可能是阻斷了其內(nèi)部自身凋亡機(jī)制的啟動(dòng)。
本研究結(jié)果從細(xì)胞生物學(xué)角度初步觀察了膝痹康對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的可能作用機(jī)制,表明膝痹康在防治膝骨關(guān)節(jié)炎方面具有潛在的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值。但由于本研究只是初步研究,力圖拓展擴(kuò)大臨床病例觀察,探索可靠的臨床療效以及更深層次的作用機(jī)制。
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(本文編輯:曹志娟)
Effects of Xibikang preparation of eliminating dampness and phlegm and blood stasis on apoptosis regulated genes expression of chondrocytes in patients with knee osteoarthritis
MENGXiangqi*,LIANGGuoqiang,YOUJunyi,etal.
*DepartmentofOrthopedicSurgery,SuzhouCityHospitalofTraditionalChineseMedicineinJiangsuProvince,Jiangsu,Suzhou215003
Objective To observe the effects of Xibikang preparation of eliminating dampness and phlegm and blood stasis the expression of apoptosis regulated genes in human knee osteoarthritis (OA) chondrocytes. Methods The chondrocytes originatef from cartilage tissue in knee OA patients after total knee replacement, which were cultured by enzyme digestion, cellular sources were identified by toluidine blue staining. The chondrocytes were divided into control group and Xibikang 0.016, 0.08, 0.4, 2.0, 10.0 mg/mL groups, the cellular proliferation in each group was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) after 24 h training. The chondrocytes were divided into control group and Xibikang low, medium and high dose groups (0.05, 0.1, 2.0 mg/mL) according to cell proliferation, the cellular apoptosis was detected by TdT-mediated Dutp nick end labeling (TUNEL), the expressions of B-cell lymphoma-2(Bcl-2) and Bcl-2-associated X protein (Bax) and p53 mRNA were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results This study successfully established a human osteoarthritis chondrocytes limited cell line, with normal growth condition, all cells originating from mesoderm chondrocytes which proved by toluidine blue. Xibi kang (range from 0.016 to 10.0 mg/mL) had effect of 24 h optical density in OA chondrocytes (ware length=450 nm). There was no statistical difference on apoptosis rate between low dose group and control group (P>0.05), but that in medium and high dose groups were decreased (P<0.05). There were significant differences on apoptosis rate through pairwise omparision among low, medium and high dose groups (P<0.05). As compared with control group, there were no significantly changes on the relative transcript level of Bcl-2, Bax and p53 mRNA in low dose group (P>0.05), the Bcl-2 mRNA was significantly up-regulated in medium and high dose group (P>0.05), and the Bax and p53 mRNA were significantly down-regulated (P<0.05,P<0.01). As compared with low dose group, the relative transcript level of Bcl-2 mRNA was significantly up-regulated in medium and high dose group (P>0.05), the Bax and p53 mRNA were significantly down-regulated (P<0.05,P<0.01). As compared with medium dose group, the relative transcript level of Bax mRNA was significantly down-regulated in high dose group (P<0.05). Conclusion Xibikang preparation of eliminating dampness and phlegm and blood stasis can regulate the expression of apoptosis genes, suppress the excessive apoptosis of chondrocytes, which may be one of the important mechanisms to inhibit cartilage destruction.
Osteoarthritis; Resolving phlegm; Apoptosis; Bcl-2-associated X protein; Bcl-2; Gene; p53
10.3969/j.issn.1002-2619.2017.01.025
※ 項(xiàng)目來(lái)源:江蘇省蘇州市科技局2014年度第十五批科技發(fā)展計(jì)劃(應(yīng)用基礎(chǔ)研究·醫(yī)療衛(wèi)生)項(xiàng)目(編號(hào):SYS201420)
孟祥奇(1972—),男,主任中醫(yī)師,博士。研究方向:脊柱及四肢骨折的中醫(yī)治療和現(xiàn)代手術(shù)治療、骨關(guān)節(jié)疾病及頸肩腰腿痛等疾病的中醫(yī)治療。
R684.3;R349.53
A
1002-2619(2017)01-0094-07
2016-08-18)
△ 通訊作者:江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科,江蘇 蘇州 215003
1 吳門(mén)醫(yī)派研究院,江蘇 蘇州 215003