侯曉龍，蔡麗平，韓航，周垂帆，王果，劉愛琴*

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州350002；2.福建農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院，福建 福州350002；3.海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州350002)

鉛脅迫對百喜草葉綠素熒光特性及酶活性的影響

侯曉龍1,2,3，蔡麗平1,2，韓航1,2，周垂帆1,2，王果2，劉愛琴1,2*

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州350002；2.福建農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院，福建 福州350002；3.海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州350002)

為探討水土保持草種在重金屬污染礦山廢棄地植被恢復中應用的可行性，以南方地區(qū)水土流失治理中廣泛應用的草種百喜草為試驗材料，設置不同Pb濃度(150，250，500，1000，1500和2500 mg/kg)的室內(nèi)土培模擬脅迫試驗，定量測定不同Pb脅迫濃度、不同脅迫時間百喜草的葉綠素熒光、SPAD值、葉綠素含量、抗氧化酶活性及MDA含量等指標，分析百喜草對Pb脅迫的生理響應。結果表明，在試驗初期(8月)，Pb脅迫對百喜草的葉綠素熒光特性具有一定抑制作用，但隨脅迫時間的增加，在試驗后期(9和10月)則表現(xiàn)出顯著的促進作用(P<0.05)；Pb脅迫對百喜草SPAD值和葉綠素含量有一定抑制作用，但作用并不顯著(P>0.05)；Pb脅迫對百喜草的POD和SOD活性均具有一定促進作用，但對百喜草CAT活性無顯著影響(P>0.05)；鉛脅迫增大百喜草體內(nèi)MDA含量，但高濃度Pb脅迫(1500和2500 mg/kg)條件下，百喜草體內(nèi)MDA含量與對照無顯著差異(P>0.05)。以上結果表明，Pb脅迫對百喜草生理特性有一定抑制作用，但抑制作用并不顯著。百喜草可通過提高葉綠素熒光特性和抗氧化酶(POD和SOD)活性，減輕Pb脅迫的危害，以適應Pb脅迫逆境環(huán)境。

百喜草；Pb脅迫；葉綠素；抗氧化酶；丙二醛

礦山開采廢棄地的治理已經(jīng)成為當前世界許多國家急需解決的重要環(huán)境問題，其中，礦山廢棄地土壤重金屬污染問題受到普遍關注，而Pb是最常見的土壤重金屬污染元素之一，土壤Pb污染問題一直為環(huán)境界研究的熱點[1-2]。重金屬污染植物修復技術應用的前提是發(fā)現(xiàn)重金屬富集植物，由于Pb具有較高的負電性，易與土壤中的有機質(zhì)和鐵錳氧化物形成共價鍵，不易被植物吸收，因此，目前國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的Pb富集植物極少[3]。

百喜草(Paspalumnotatum)——禾本科雀稗屬植物，具有耐貧瘠、抗干旱、覆蓋性好、須根發(fā)達、固地性強等特點，是一種抗逆性較強的植物，在南方水土流失治理中有廣泛的應用[4]。百喜草對逆境具有一定耐性，可利用其粗壯的匍匐莖快速擴展，顯現(xiàn)出強大的競爭力[5]。夏漢平等[6]研究發(fā)現(xiàn)，百喜草在純尾礦或由尾礦和垃圾組成的混合基質(zhì)上正常生長，比香根草(Vetiveriazizanioides)具有更強的重金屬抗性。龐玉建[7]研究表明，百喜草可在Cu、Zn復合污染環(huán)境中生長，而且對Cu和Zn具有一定富集能力。百喜草對Pb脅迫具有一定耐性，在土壤Pb濃度2500 mg/kg條件下仍可生長，鉛脅迫對百喜草分蘗能力、根系形態(tài)等生長指標有一定抑制作用，但對株高抑制作用不明顯，且對不同植物部位生長影響存在一定差異[8]。龍健等[9]研究發(fā)現(xiàn)，百喜草可在重金屬含量極高的銅尾礦生長，且對重金屬的抗性高于葦狀羊茅(Festucaarundinacea)、黑麥草(Loliumperenne)和狗牙根(Cynodondactylon)。但百喜草是否存在對Pb脅迫的特殊生理響應機制尚不清楚，限制了其在Pb污染土壤治理中的應用。

鑒于此，本研究以南方主要的水土保持草種百喜草為研究對象，設置不同Pb濃度的脅迫試驗，測定不同Pb脅迫條件下，百喜草的葉綠素熒光、SPAD值、葉綠素含量、抗氧化酶活性及丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量等指標，分析百喜草對Pb脅迫的生理響應，為百喜草在Pb污染土壤中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試百喜草種子購買自深圳鑫淼森園林草坪有限公司，種子的發(fā)芽率85%，含水量0.01%，千粒重25 g。選取均勻飽滿的百喜草種子，在人工氣候箱中進行發(fā)芽，培養(yǎng)供試百喜草植株。試驗基質(zhì)采用黃心土和河沙(可減少其他元素對試驗的影響)按體積比4∶1混合，黃心土采自福州林地自然土壤，河沙采自福州烏龍江。黃心土風干后過5 mm的尼龍篩，然后與晾干的河沙混合。基質(zhì)的pH為5.49，有機質(zhì)、全N、全P和全K含量分別為：17.51 g/kg、0.22 g/kg、0.03 g/kg和35.16 g/kg；水解性N、有效P和速效K含量分別為：0.05 mg/kg、0.05 mg/kg和42.64 mg/kg；Pb、Zn、Cu和Cr含量分別為：0.85 mg/kg、3.95 mg/kg、3.10 mg/kg和0.40 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗采用塑料桶作為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)桶直徑27 cm，高30 cm?；|(zhì)填充高度為27 cm(共計8 kg，以干土計)，留3 cm無Pb的緩沖層(重1.5 kg，以干土計)。根據(jù)南方鉛鋅礦區(qū)土壤Pb含量情況和我國土壤環(huán)境質(zhì)量標準(GB 15618-1995)[10]，設計6個Pb濃度的單因素重復脅迫試驗處理：150、250、500、1000、1500和2500 mg/kg，分別標記為：BH1、BH2、BH3、BH4、BH5和BH6，同時設置不施加Pb的對照(CK)，每個處理5個重復。Pb的施加用醋酸鉛[(CH3COO)2Pb·3H2O]，脅迫試驗前一次性均勻混入相應處理培養(yǎng)桶的基質(zhì)中。

2012年6月15日，選擇長勢一致、高10 cm、生長良好的百喜草植株，分別移栽至所設置不同Pb濃度脅迫處理的培養(yǎng)桶中心。每個培養(yǎng)桶移栽百喜草幼苗2株，移栽過程注意保持根系自然伸展。試驗在玻璃溫室中(晝/夜：溫度23.0 ℃/29.3 ℃，濕度42.7%/67.7%)進行。為保證植株生長過程中對其他養(yǎng)分的需求，每7 d澆一次1/4營養(yǎng)液100 mL，每3 d澆去離子水100 mL。營養(yǎng)液采用Hoagland配方，調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH為5.5。2012年10月15日完成試驗，收獲植株。

1.3 試驗測定方法

1.3.1 葉綠素熒光 分別在8-10月，每月中旬選擇晴朗無風的天氣，采用美國OP公司生產(chǎn)的OP-30P型便攜式葉綠素熒光儀，測定百喜草第3片葉的熒光特性，葉片先暗適應20 min，然后測定初始熒光F0、最大熒光Fm，計算PSⅡ最大光化學效率Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm和PSⅡ潛在活性Fv/F0=(Fm-F0)/F0。

1.3.2 葉片SPAD值 分別在8-10月，每月中旬選擇晴朗無風的天氣，用日本產(chǎn)美能達SPAD 502 plus 葉綠素儀，隨機選擇百喜草植株中部不同方位的5片葉子，測定SPAD值，每片葉3次讀數(shù)，取平均值。

1.3.3 葉綠素含量 葉綠素含量測定采用朱廣廉等[11]的乙醇-丙酮提取法。在脅迫的90 d后，選擇各處理位置一致的新鮮百喜草3片葉進行葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量的測定。

1.3.4 酶活性 在脅迫90 d后，稱取0.2 g百喜草葉片于預冷的研缽中，加入1 mL預冷的磷酸緩沖液，在冰浴上研磨成漿，然后轉(zhuǎn)入到10 mL離心管中，再分別用1 mL緩沖液沖洗研缽3次，沖洗液全部轉(zhuǎn)入離心管中，最終體積為4 mL。然后在4 ℃下10000 r/min離心20 min，取上清液定容至10 mL，于4 ℃下低溫保存，作為待測液，用于過氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和丙二醛(MDA)含量的測定。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法進行測定[12]；SOD活性采用氮藍四唑法進行測定[12]；CAT活性采用紫外吸收法測定[12]；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，用Origin 7.5軟件作圖。數(shù)據(jù)為5個重復的平均值±標準差。多重比較采用Tukey法(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 Pb脅迫對百喜草葉綠素熒光特性的影響

由圖1可知，Pb脅迫條件下，在脅迫試驗初期(8月)百喜草葉片各熒光參數(shù)均小于無Pb對照，但除250 mg/kg處理的Fm、Fv/Fm和Fv/F0，以及1000 mg/kg處理的F0、Fv/Fm和Fv/F0外，其他均與對照無顯著差異(P>0.05)；在脅迫試驗中期(9月)，不同Pb濃度的F0、Fm、Fv/Fm和Fv/F0均與不施Pb對照差異不顯著(P>0.05)；脅迫末期(10月)，百喜草葉片在1000 mg/kg處理的初始熒光F0，以及各Pb濃度脅迫處理的最大熒光Fm、PSⅡ最大光化學效率和PSⅡ潛在活性均顯著大于不施Pb對照(P<0.05)；百喜草的葉綠素熒光各參數(shù)，在同一脅迫濃度，不同脅迫時間基本表現(xiàn)為逐漸增大的趨勢。說明Pb脅迫初期對百喜草的葉綠素熒光具有一定抑制作用，但隨著其逐漸適應Pb脅迫環(huán)境，在脅迫試驗后期，對百喜草熒光特性的促進作用越來越明顯。

2.2 Pb脅迫對百喜草葉片SPAD值的影響

由圖2可知，百喜草葉片SPAD值，除150 mg/kg處理在10月份略大于對照外，其他不同Pb濃度脅迫、不同脅迫時間均小于對照；隨Pb脅迫濃度的增大，百喜草SPAD值在脅迫初期(8月)和中期(9月)呈先增大后減小的趨勢，而在脅迫后期(10月)則呈現(xiàn)出先減小后略有增大的趨勢；隨脅迫時間的增加，低濃度Pb脅迫處理(<500 mg/kg)，百喜草葉片SPAD值表現(xiàn)為逐漸增大的趨勢，在500 mg/kg處理表現(xiàn)為先增大后減小，而高濃度鉛脅迫處理(>500 mg/kg)，則表現(xiàn)為先減小后增大的趨勢；但除1500 mg/kg處理在脅迫初期(8月)和中期(9月)顯著小于對照外(P<0.05)，其他處理的SPAD值均與對照無顯著差異(P>0.05)。說明Pb脅迫對百喜草葉片SPAD值影響較小。

2.3 Pb脅迫對百喜草葉綠素含量的影響

由表1可知，Pb脅迫條件下，百喜草葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均小于對照，但除150 mg/kg處理的葉綠素總量顯著小于對照外，其他均與對照無顯著差異(P>0.05)；百喜草葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均隨Pb脅迫濃度的增大呈逐漸增大的趨勢；百喜草葉片葉綠素a/b，在Pb濃度500、1500和2500 mg/kg處理大于無Pb對照，其他處理則小于對照，但均與對照無顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同Pb脅迫處理百喜草葉片熒光特性Fig.1 Chlorophy fluorescence parameters of P. notatum under different Pb stress 同一脅迫時期不同Pb脅迫濃度處理出現(xiàn)相同字母表示P=0.05水平上差異不顯著。Different level of soil Pb concentration at the same stress stage, bars with the same letter are not significantly different based on par-wise T-test at 5% level of significance. F0：初始熒光Initial fluorescence; Fm: 最大熒光Maximum fluorescence; Fv/F0:PSⅡ潛在活性Potential activity; Fv/Fm:PSⅡ 最大光化學效率The maximum PSⅡ photochemical efficiency; BH1, BH2, BH3, BH4, BH5, BH6 are 150, 250, 500, 1000, 1500, 2500 mg/kg Pb.下同The same below.

圖2 不同Pb脅迫處理百喜草葉片SPAD值Fig.2 SPAD of P. notatum under different Pb stress

2.4 Pb脅迫對百喜草葉片抗氧化酶活性的影響

由表2可知，低Pb濃度(150 mg/kg)和高Pb濃度(大于1500 mg/kg)處理百喜草葉片POD活性小于對照，但其他處理則顯著大于對照(P<0.05)；不同Pb脅迫處理百喜草葉片SOD活性均大于對照，其中150、250和500 mg/kg處理顯著大于對照(P<0.05)；Pb脅迫條件下，百喜草葉片CAT活性均小于對照，其中Pb脅迫濃度小于500 mg/kg處理顯著小于對照，而大于1000 mg/kg處理則與對照無顯著差異(P>0.05)；在Pb脅迫濃度150～500 mg/kg范圍，隨Pb脅迫濃度的增大，百喜草葉片POD和SOD活性呈逐漸增大的趨勢，500 mg/kg后呈逐漸減小的趨勢。說明低濃度鉛脅迫條件下，百喜草可通過提高葉片POD和SOD活性， 從而適應Pb脅迫環(huán)境，但高濃度Pb脅迫環(huán)境對其葉片POD活性有顯著抑制作用， 但對CAT活性影響較小。

2.5 Pb脅迫對百喜草葉片MDA含量的影響

由圖3可知，隨Pb脅迫濃度的增大，百喜草葉片MDA含量呈先增大后減小的趨勢，在500mg/kg處理達最大；除1500mg/kg處理外，其他處理百喜草葉片MDA含量均大于對照，但除500mg/kg處理顯著大于對照外，其他處理均與對照無顯著差異(P>0.05)。說明鉛脅迫對百喜草具有一定毒害作用，但影響并不顯著。

3 討論

重金屬脅迫對一般植物的生長及生理生化特性具有抑制作用，而耐性植物可以通過自身生理特性的改變，以適應脅迫環(huán)境[14]。葉綠素熒光作為光合作用的探針，不僅能反映光能吸收、激發(fā)能傳遞和光化學反應等光合作用過程，而且與ATP合成和CO2固定等過程有關，幾乎所有光合作用過程的變化可通過葉綠素熒光反映出來。本研究發(fā)現(xiàn)Pb脅迫初期對百喜草的葉綠素熒光特性具有一定抑制作用，但隨脅迫時間的增加促進作用越來越明顯，且隨Pb脅迫濃度的增大，其葉綠素熒光特性呈逐漸增大的趨勢。李朝陽等[15]研究表明，濕地匍燈蘚在Pb脅迫初期可通過應激性增加PSⅡ活性來抵御重金屬的毒害，但由于電子傳遞和熱耗散能力較弱，使PSⅡ活性中心受損，最終導致光合系統(tǒng)損傷。李亞藏等[16]研究發(fā)現(xiàn)鉛污染對山梨葉綠素熒光特性有促進作用，本研究與這些研究結果存在一些不同之處，說明不同植物對重金屬脅迫的熒光特性響應存在一定差異，表明百喜草可通過葉綠素熒光特性的改變適應高濃度Pb脅迫，可能是其對Pb脅迫的重要響應機理，但其從初期抑制到后期促進明顯的轉(zhuǎn)變過程及機理尚不清楚，有待進一步試驗研究。

表1 不同脅迫處理百喜草葉片葉綠素含量Table 1 Chlorophyll content of P. notatum under different Pb stress

表2 不同Pb脅迫處理百喜草葉片抗氧化酶活性Table 2 Antioxidative enzyme activities of P. notatum under different Pb stress

圖3 不同Pb脅迫處理百喜草葉片MDA含量Fig.3 MDA content of P. notatum under different Pb stress

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起核心作用，葉綠素具有解毒、抗病等多種用途。本研究發(fā)現(xiàn)，Pb脅迫對百喜草葉綠素含量無顯著抑制作用，隨Pb脅迫濃度的增大呈增大的趨勢；馮鵬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Pb脅迫條件下，隨Pb脅迫濃度的增大，黑麥草葉片葉綠素含量呈遞增趨勢，本研究結果與此一致。而劉大林等[18]研究表明，隨Pb脅迫時間的延長，早熟禾(Poaannua)葉綠素含量呈先升后降的趨勢。本研究結果與此有一定差異，說明不同植物對Pb脅迫的響應存在一定差異，特別是耐性植物對Pb脅迫具有特殊的適應策略。

抗氧化酶系統(tǒng)可清除植物自身有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，對提高植物抗逆性具有重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)Pb脅迫對百喜草葉片POD和SOD活性具有一定促進作用，但Pb濃度大于1500 mg/kg后抑制作用明顯。說明耐性植物可以通過提高抗氧化酶活性，從而適應Pb脅迫環(huán)境，但其通過自身生理調(diào)節(jié)適應有一定限度。趙鋼等[20]研究發(fā)現(xiàn)，隨Pb脅迫濃度的增加，苦蕎(Fagopyrumtataricum)體內(nèi)丙二醛、超氧陰離子自由基含量均逐漸增加。低濃度Pb脅迫促進苦蕎SOD、POD和CAT活性，但隨Pb脅迫濃度的增大，各項指標均顯著下降。朱啟紅等[21]研究表明，Pb脅迫條件下，蜈蚣草(Eremochloaciliaris)體內(nèi)POD和CAT活性在脅迫初期明顯升高，但隨脅迫濃度的增大，兩種酶的活性則呈下降趨勢，而SOD活性和葉綠素含量則呈下降趨勢。本研究結果與這些研究結果一致，說明低濃度Pb脅迫條件下，耐性植物可通過提高抗氧化酶活性，從而達到對Pb脅迫的解毒，但高濃度Pb脅迫條件下，對其葉片抗氧化酶活性有一定抑制作用。百喜草可適應高濃度的Pb脅迫條件，其可能通過酶活性的改變影響其他形態(tài)或生理指標，從而實現(xiàn)其對高濃度Pb的適應或解毒，但其轉(zhuǎn)變過程及其機理還有待進一步研究。

4 結論

1) Pb脅迫初期對百喜草的葉綠素熒光特性具有一定抑制作用，但隨脅迫時間的增加，則逐漸表現(xiàn)出促進作用，且促進作用越來越明顯；Pb脅迫對百喜草SPAD值和葉綠素含量有一定抑制作用，但作用不顯著，且百喜草葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均隨Pb脅迫濃度的增大呈逐漸增大的趨勢。

2) Pb脅迫對百喜草的POD和SOD活性具有一定促進作用，但Pb濃度大于1500 mg/kg后則表現(xiàn)出顯著抑制作用；高濃度Pb脅迫對百喜草CAT活性無顯著影響；Pb脅迫條件下百喜草體內(nèi)MDA含量提高，但高濃度Pb脅迫處理MDA含量與對照無顯著差異。

3)百喜草可通過提高葉綠素熒光特性和抗氧化酶(POD和SOD)活性，減輕Pb脅迫的危害，以適應Pb脅迫逆境環(huán)境。

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Effect of lead stress on the chlorophyll fluorescence characteristics and antioxidative enzyme activities ofPaspalumnotatum

HOU Xiao-Long1,2,3, CAI Li-Ping1,2, HAN Hang1,2, ZHOU Chui-Fan1,2, WANG Guo2, LIU Ai-Qin1,2*

1.CollegeofForestry,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China; 2.CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China; 3.Cross-StraitCollaborativeInnovationCenterofSoilandWaterConservation,Fuzhou350002,China

Paspalumnotatumis considered one of the best grass species for controlling soil and water loss in south China. To test the feasibility ofP.notatumas a restoration plant in mining wasteland, a pot experiment was undertaken with various concentrations of lead (Pb) (150, 250, 500, 1000, 1500 and 2500 mg/kg). Chlorophyll fluorescence, SPAD value, chlorophyll content, antioxidative enzyme activities and malondialdehyde content were measured to investigate physiological responses to Pb stress. The inhibitory effect of Pb stress on chlorophyll fluorescence was observed at the early stage (August), while significant promotion was found at later stages (September and October). Pb stress inhibited the SPAD value of chlorophyll and the chlorophyll content ofP.notatum, but no significant differences from the control were observed. Pb stress promoted the activities of peroxidase and superoxide dismutase, but showed little effect on catalase activity. Malondialdehyde content ofP.notatumincreased under Pb stress, but there were no significant differences from the control at higher Pb concentrations. These results demonstrate that Pb stress inhibits some physiological characteristics inP.notatumand that the antioxidant system and chlorophyll fluorescence may play important roles in alleviating Pb toxicity.

Paspalumnotatum; lead stress; chlorophyll; antioxidative enzyme; malondialdehy

2016-04-12；改回日期：2016-06-28

國家科技支撐計劃項目(2014BAD15B02)，國家自然科學基金(41401364)，國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研項目(201304303)和農(nóng)業(yè)高校產(chǎn)學合作科技重大項目(2013N5002)資助。

侯曉龍(1981-)，男，山西永濟人，副教授，博士。E-mail: lxyhxl@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail: fjlaq@126.com

10.11686/cyxb2016159 http://cyxb.lzu.edu.cn

侯曉龍, 蔡麗平, 韓航, 周垂帆, 王果, 劉愛琴. 鉛脅迫對百喜草葉綠素熒光特性及酶活性的影響. 草業(yè)學報, 2017, 26(3): 142-148.

HOU Xiao-Long, CAI Li-Ping, HAN Hang, ZHOU Chui-Fan, WANG Guo, LIU Ai-Qin. Effect of lead stress on the chlorophyll fluorescence characteristics and antioxidative enzyme activities ofPaspalumnotatum. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(3): 142-148.