呂健勇+胡永斌

【摘要】 目的：對(duì)筆者所在醫(yī)院接受治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者的生物樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究，分析G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）和磷酸化AKT蛋白（P-AKT）在腫瘤組織中表達(dá)的意義，并進(jìn)行二者之間相關(guān)性分析。方法：選取2011年-2012年來筆者所在醫(yī)院接受治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者180例的活體組織樣本和50例正常子宮組織制成蠟塊切片，采用EnViSion免疫組化法和FISH法對(duì)每個(gè)標(biāo)本中的GPR30和P-AKT進(jìn)行其相關(guān)的基因陽性表達(dá)水平進(jìn)行檢測，觀察免疫組化評(píng)分與FISH檢測G蛋白偶聯(lián)受體30和磷酸化AKT蛋白的高表達(dá)與基因擴(kuò)增之間的重疊率，統(tǒng)計(jì)二者在不同的腫瘤組織中表達(dá)率，影響二者的表達(dá)因素及二者相關(guān)性探究。結(jié)果：GPR30和P-AKT的免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達(dá)與FISH檢測結(jié)果重疊率分別為74.5%、56.6%，差異顯著（P<0.05）；GPR30和P-AKT在正常子宮內(nèi)膜中陽性表達(dá)率均明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌內(nèi)陽性表達(dá)率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GPR30和P-AKT的表達(dá)與患者的年齡、組織分化程度、是否出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移及基層浸潤深度有關(guān)（P<0.05）；GPR30和P-AKT之間存在明顯的相關(guān)性，且相關(guān)性較好（字2=14.08，P<0.05，Φ=0.2693）。結(jié)論：FISH法與EnViSion免疫組化法檢測GPR30和P-AKT重疊率較好，GPR30和P-AKT與子宮內(nèi)膜腺癌之間可能存在因果聯(lián)系，且CPR30和P-AKT之間能夠相互影響，在臨床治療過程中可根據(jù)GPR30和P-AKT判斷組織分化程度和基層浸潤深度，在明確診斷上有一定的意義。

【關(guān)鍵詞】 G蛋白； 偶聯(lián)受體； AKT蛋白； 宮內(nèi)膜腺癌； 表達(dá)及意義

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.7.022 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2017）07-0044-03

子宮內(nèi)膜癌屬于發(fā)生于子宮內(nèi)的上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，使得子宮上皮細(xì)胞的凋亡機(jī)制被抑制，從而使得部分異常子宮內(nèi)膜細(xì)胞無限增殖，進(jìn)而由于壓迫和占位性病變而危及患者生命安全[1-2]。一般絕經(jīng)期前后女性發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的概率較高，也是女性生殖系統(tǒng)的三大癌癥同程度的陰道排液、陣發(fā)性腹部疼痛及相關(guān)身體征象。目前臨床上的治療方法主要有外科手術(shù)、放化療、激素治療及中醫(yī)治療。G蛋白偶聯(lián)受體30屬雌激素受體，與雌激素結(jié)合后釋放AKT相關(guān)因子，使得AKT系統(tǒng)被激活。相關(guān)研究指出，AKT系統(tǒng)是促進(jìn)癌細(xì)胞生長的主要系統(tǒng)[3-4]。目前臨床上關(guān)于AKT信號(hào)系統(tǒng)的研究處于白熱化階段，而對(duì)與AKT與P-AKT之間的關(guān)系描述較少，而且對(duì)于GPR30與P-AKT之間關(guān)系的研究較少。因此，本文旨在通過對(duì)近1年來筆者所在醫(yī)院接受治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者的生物樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究分析GPR30和P-AKT在腫瘤組織中表達(dá)的意義，并進(jìn)行二者之間相關(guān)性分析。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取自2011年10月25日-2012年10月25日來筆者所在醫(yī)院接受治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者180例的活體組織樣本和50例正常子宮組織制成蠟塊切片。子宮內(nèi)膜腺癌患者活體組織樣本中增生期內(nèi)膜40例，子宮內(nèi)膜增殖癥34例，子宮內(nèi)膜樣腺癌106例?；颊吣挲g31～68歲，平均（46.8±10.2）歲。所有患者均為初治患者，且有明確的生存信息和臨床分期，所有患者手術(shù)切除的新鮮腫瘤標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定后石蠟包埋，制成蠟塊保存。所有樣本均由兩名以上專業(yè)病理醫(yī)師確診，排除其他惡性腫瘤并發(fā)，排除繼發(fā)患者，排除其他重大疾病的患者。

1.2 方法

標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)用FISH法檢測并記錄數(shù)據(jù)。應(yīng)用EnViSion免疫組化二步法檢測患者腫瘤組織中GPR30、P-AKT，選用己知陽性的子宮內(nèi)膜腺癌切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。染色方法如下：（1）脫蠟和水化，取每張4 mm厚的患者腫瘤芯片，將組織芯片置于65 ℃恒溫中5 h；再將其先后加入到二甲苯Ⅰ和Ⅱ溶液里浸泡15 min隨后將其放入C2H5OH Ⅰ和Ⅱ各沖洗5 min，在無水乙醇Ⅱ中再浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min；蒸溜水中浸泡5 min。（2）抗原修復(fù)，取一定量的0.01 M梓檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）進(jìn)行加熱；將組織置于緩沖液中并置于加熱箱中繼續(xù)加熱10～15 min；隨后將其冷卻，并用蒸餾水和PBs緩沖液沖洗3次，5 min/次[4]。（3）免疫組織化學(xué)染色，用蒸餾水配置新鮮的3% HA，室溫封閉15 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗2次，5 min/次；再用PBS洗兩次，持續(xù)5 min；應(yīng)用山羊血清對(duì)標(biāo)本進(jìn)行密封，室溫60 min；取出切片，繼續(xù)用PBS緩沖液進(jìn)行3次沖洗，共15 min；滴加即用型快捷免疫組化Max Vision二抗試劑，濕盒中室溫靜置15 min；PBS洗

3次，5 min/次；將其置于DAB中維持2～8 min，實(shí)時(shí)在鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPR30與P-AKT的高表達(dá)與基因擴(kuò)增之間的重疊率

GPR30的免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達(dá)率為58.8%（106/180），其中+28例，++69例，+++9例，而FISH檢測結(jié)果顯示GPR基因擴(kuò)增率為51.1%（92/180），重疊率為74.5%（79/106）。P-AKT免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達(dá)率為58.8%（106/180），其中+31例，++52例，++23例，而FISH檢測結(jié)果顯示P-AKT基因擴(kuò)增率為36.7%（66/180），重疊率為56.6%（60/106）。二者各個(gè)免疫組化間的重疊率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 二者在正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)情況

GPR30在正常子宮內(nèi)膜中陽性表達(dá)率明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌內(nèi)陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明子宮內(nèi)膜腺癌患者的子宮內(nèi)膜組織中GPR30和P-AKT表達(dá)升高，即GPR30和P-AKT與子宮內(nèi)膜腺癌之間可能存在因果聯(lián)系，見表2。

2.3 GPR30、P-AKT與相關(guān)因素的相關(guān)性分析

GPR30和P-AKT的表達(dá)與患者的年齡、組織分化程度、是否出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移以及基層浸潤深度有關(guān)（P<0.05）。因此，在臨床治療過程中可根據(jù)GPR30和P-AKT判斷組織分化程度和基層浸潤深度，在明確診斷上有一定的意義，見表3。

2.4 GPR30和P-AKT相關(guān)性研究

經(jīng)過資料取證及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，GPR30和P-AKT之間存在明顯的相關(guān)性（字2=14.08，P<0.05，Φ=0.2693），說明CPR30和P-AKT之間能夠相互影響，見表4。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性群體中最為第二大的生殖道腫瘤。有人以循證醫(yī)學(xué)的方式通過Mata分析對(duì)幾千例子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)患病者的病因與不良的生活方式以及惡性工作環(huán)境有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，孕激素與雌激素平衡被破環(huán)后，孕激素失去拮抗作用，容易增加子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)，而究竟是孕激素還是雌激素是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜腺癌的主要因子且致病機(jī)制尚不明確[5-9]。目前公認(rèn)的為“核轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”，即雌激素與其受體相結(jié)合后激發(fā)核內(nèi)相關(guān)遺傳物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，合成相應(yīng)蛋白，促進(jìn)腺癌細(xì)胞增殖。近期研究表明，除此機(jī)制外，雌激素還可以激活A(yù)KT信號(hào)系統(tǒng)，是通過與GRP30受體相結(jié)合實(shí)現(xiàn)。GRP30廣泛的存在于人體，其與雌激素結(jié)合能夠迅速的激活并促使AKT發(fā)生磷酸化即P-AKT，而P-AKT能夠促進(jìn)癌細(xì)胞生長。而關(guān)于GRP30與p-AKT之間的關(guān)系尚不清楚，因此，本文旨在通過對(duì)近一年來筆者所在醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜腺癌患者的生物樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究，分析GPR30和P-AKT在腫瘤組織中表達(dá)的意義，并進(jìn)行二者之間相關(guān)性分析。

GPR30的免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達(dá)率為58.8%（106/180），而FISH檢測結(jié)果顯示GPR基因擴(kuò)增率為51.1%（92/180），重疊率為74.5%（79/106）。P-AKT免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達(dá)率為58.8%（106/180），而FISH檢測結(jié)果顯示P-AKT基因擴(kuò)增率為36.7%（66/180），重疊率為56.6%（60/106）。二者的各個(gè)免疫組化間的重疊率差異顯著，如要進(jìn)行多組間的兩兩比較需要進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)，說明FISH法與EnViSion免疫組化法檢測GPR30和P-AKT重疊率較好；經(jīng)過資料取證及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，GPR30在正常子宮內(nèi)膜中陽性表達(dá)率明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌內(nèi)陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P-AKT在正常子宮內(nèi)膜中陽性表達(dá)率明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌內(nèi)陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GPR30和P-AKT的表達(dá)與患者的年齡、組織分化程度、是否出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移及基層浸潤深度有關(guān)；經(jīng)過資料取證及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，GPR30和P-AKT之間存在明顯的相關(guān)（字2=14.08，Φ=0.2693），說明GPR30和P-AKT與子宮內(nèi)膜腺癌之間可能存在因果聯(lián)系，且CPR30和P-AKT之間能夠相互影響，在臨床治療過程中可根據(jù) GPR30和P-AKT判斷組織分化程度和基層浸潤深度，在明確診斷上有一定的意義。

綜上所述，雌激素能夠與GRP30結(jié)合并迅速激活P-AKT通路，釋放因子促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。在子宮內(nèi)膜腺癌組織內(nèi)二者表達(dá)水平均高于正常子弄內(nèi)膜組織，且二者之間可能存在一定的因果聯(lián)系，能夠應(yīng)用于臨床上對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌進(jìn)行進(jìn)一步診斷。

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（收稿日期：2016-11-18）