黃麗芳　董云萍　王曉陽(yáng)　孫燕　陳鵬　林興軍　閆林

摘 要 選用4份咖啡種質(zhì)資源為材料，對(duì)S1-S100共100個(gè)RAPD引物進(jìn)行篩選，選出多態(tài)性好的引物10個(gè)。利用這10個(gè)RAPD引物對(duì)28份咖啡資源進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得86條帶，平均每個(gè)RAPD引物擴(kuò)增出8.6條帶，多態(tài)性譜帶74條，多態(tài)性條帶比率為86.0%。結(jié)果表明：供試咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富；10個(gè)多態(tài)性好的RAPD引物中S8的鑒別效率最高，能將全部供試材料全部區(qū)分開，通過(guò)整合軟件錄入如所屬種類、種質(zhì)名稱、采樣地點(diǎn)、引物、RAPD-PCR 擴(kuò)增數(shù)據(jù)以及電泳圖片等相關(guān)信息，形成指紋圖譜二維編碼，構(gòu)成咖啡種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜，為咖啡種質(zhì)資源品種權(quán)益保護(hù)及分子身份證構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 咖啡 ；種質(zhì)資源 ；RAPD ；指紋圖譜

中圖分類號(hào) TS273 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.008

咖啡（Coffea spp.）為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）多年生常綠灌木或小喬木，原產(chǎn)非洲北部和中部的熱帶地區(qū)。咖啡屬植物約有100多個(gè)種，通常所指的咖啡為小粒種、中粒種、大粒種和查理種。目前全世界馴化栽培的主要有小粒種（C. arabica L.）和中粒種（C. canephora Pierre），面積約占70%和30%[1-3]。小粒種咖啡為異源四倍體種，自花授粉，而其他種均為二倍體，異花授粉。實(shí)際生產(chǎn)中，咖啡生產(chǎn)者在來(lái)源或者遺傳背景不甚明了的情況下進(jìn)行雜交或嫁接，以及地域間的引種利用等造成咖啡品種品系良莠不齊，變異性大，產(chǎn)生了大量的同物異名和同名異物，導(dǎo)致種子、種苗市場(chǎng)混亂的局面，阻礙咖啡產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。傳統(tǒng)的咖啡品種真實(shí)性和純度是通過(guò)形態(tài)學(xué)、化學(xué)物質(zhì)含量分析或者進(jìn)行杯品等方法鑒定的[4-6]，耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、較難做到準(zhǔn)確鑒別咖啡品種基因型。因此，對(duì)咖啡的核心種質(zhì)的構(gòu)建、種質(zhì)的分類及真?zhèn)舞b定、品種權(quán)益保護(hù)等方面的研究顯得十分必要。

DNA指紋圖譜（DNA fingerprint）是鑒別不同品種、品系和不同無(wú)性系、不同基因型，以及辨別親本與雜交后代遺傳相關(guān)等方面的有力工具[7-9]，RAPD標(biāo)記是以PCR為基礎(chǔ)，采用隨機(jī)引物對(duì)未知序列的DNA進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增的多態(tài)性來(lái)反映基因組DNA相應(yīng)區(qū)域的遺傳關(guān)系，具有實(shí)驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單、所需儀器設(shè)備少、快速簡(jiǎn)便，通用性好，且無(wú)須事先知道目的DNA片斷序列信息等許多優(yōu)點(diǎn)，在生物的遺傳多樣性檢測(cè)、品系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用[10-12]。

近年來(lái)，咖啡的分子標(biāo)記研究也取得了一些進(jìn)展。王曉陽(yáng)等[13]從514對(duì)SSR引物中篩選出1對(duì)特異性引物進(jìn)行中小粒種咖啡的鑒定。該引物在小粒種中可擴(kuò)增出雙帶，在中粒種中擴(kuò)增出單帶，從擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目即可進(jìn)行中小粒咖啡的鑒別。黃麗芳等[14]用篩選獲得的18條RAPD多態(tài)性引物對(duì)72份咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，結(jié)果表明，咖啡資源在種的分類水平上存在遺傳關(guān)系多樣性，部分資源的分類學(xué)地位與地理來(lái)源無(wú)相關(guān)性。本文利用RAPD標(biāo)記技術(shù)，對(duì)28份咖啡資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并篩選出穩(wěn)定的，多態(tài)性好的RAPD引物，構(gòu)建DNA指紋圖譜，為咖啡資源的分子身份證構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為28份咖啡種質(zhì)資源，其中大粒及查理種咖啡5份（編號(hào)1～5），小粒種咖啡10份（編號(hào)6～15），中粒種咖啡13份（編號(hào)16～28）。材料采自于海南，云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（簡(jiǎn)稱德宏所），云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所（簡(jiǎn)稱熱經(jīng)所），中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所（簡(jiǎn)稱香飲所）。詳見表1。

1.2 基因組DNA的提取

采用CTAB改良法進(jìn)行咖啡葉片基因組DNA的提取[15]。提取的DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量，稀釋至20 ng/μL，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選及RAPD擴(kuò)增

利用4份差異較大的咖啡模板，對(duì)RAPD引物S1-S100共100條隨機(jī)引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，從中選取多態(tài)性好且擴(kuò)增條帶清晰的對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為本課題組優(yōu)化過(guò)的咖啡RAPD反應(yīng)體系[16]：20 μL體系中，含ddH2O 13.75 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.6 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.2 μL，引物（10 μmol/L）1.2 μL，Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，基因組DNA（20 ng/μL）1 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，38℃退火1 min 45 s，72℃延伸2 min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察，以DL 2 000 Marker為參照，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴(kuò)增引物的遷移率，利用人工方法統(tǒng)計(jì)讀帶，將清晰度高、重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶賦值“1”，無(wú)條帶或肉眼分辨不清的弱帶賦值“0”，導(dǎo)入Excel 表格生成數(shù)據(jù)矩陣。通過(guò)多態(tài)性條帶比率、品種最大相似系數(shù)及品種聚類區(qū)分率（Rate of distinguishing variety by cluster，RDVC）鑒別引物。采用NTSYSpc 2.1軟件，根據(jù)Nei和Li相似系數(shù)計(jì)算遺傳相似性GS（genetic similarity），根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。RDVC=（N-Ni）/N，Ni 為無(wú)法區(qū)分品種數(shù)，N為品種總數(shù)。

1.5 指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)RAPD電泳擴(kuò)增結(jié)果，從多態(tài)性比較豐富的引物中選出至少一條可將所有供試品種區(qū)分且表現(xiàn)優(yōu)異的RAPD引物，構(gòu)建咖啡品種（系）的DNA指紋圖譜?？Х鹊腄NA指紋圖譜一部分是RAPD擴(kuò)增數(shù)據(jù)，由二進(jìn)制代碼組成，另一部分是結(jié)合草料二維碼在線生成器（www.cli.im）將咖啡的種質(zhì)名稱、種屬、采樣地點(diǎn)、引物名稱、RAPD數(shù)據(jù)代碼[17]，RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)圖片等信息錄入軟件中，形成指紋圖譜二維編碼[18]，可以更加快捷方便的進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。詳見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD引物篩選與擴(kuò)增片段多態(tài)性

以4份差異較大的咖啡基因組DNA為模板，對(duì)S1-S100共100個(gè)RAPD引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，篩選出10個(gè)多態(tài)性較好的引物。利用這10個(gè)引物對(duì)28份材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的位點(diǎn)多態(tài)性數(shù)目為5～12條，產(chǎn)物片段大小介于350～2 000 bp ，以引物S8和S19擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最多，10個(gè)引物共擴(kuò)增出86個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8.6條譜帶，其中多態(tài)性帶74條，多態(tài)性條帶比例為86.0%，其中S8引物多態(tài)性最為豐富。詳見表3。

2.2 聚類分析

28份咖啡材料間的相似性系數(shù)變幅為0.337 8～0.905 4。其中小粒種喀麥?。?3）和中粒種熱研2 號(hào)（17）的相似系數(shù)最小，為0.337 8，說(shuō)明二者間的遺傳距離最遠(yuǎn)，遺傳差異最大。小粒種CCC24（8）和鐵畢卡（11），中粒種興32（24）和興30（26）相似系數(shù)最大，都為0.905 4，表明它們之間的遺傳距離最小，遺傳差異最小。從種內(nèi)遺傳相似系數(shù)看，2份大粒種的相似系數(shù)為0.635 1，查理種種內(nèi)最小相似系數(shù)為查理中果（4）和查理大果（5），為0.702 7，最大相似系數(shù)為查理小果（3）和查理大果（5），為0.878 4。小粒種CATIMOR P88（7）和巴布亞新幾內(nèi)亞（14），中粒種興32（24）和興31（25），它們種內(nèi)最小相似系數(shù)分別為0.662 2和0.608 1。

UPGMA 聚類結(jié)果（圖1）分析，該聚類圖在相似性系數(shù)為0.608水平下可劃分為3大類。第Ⅰ類群包括5份材料，包括2份大粒種和3份查理種，第Ⅱ類群包括全部13份中粒種材料，第Ⅲ類群包括了全部的小粒種。聚類分析結(jié)果表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3大類群種間關(guān)系清晰，聚類結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果一致。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)10條引物擴(kuò)增譜帶的多態(tài)性，能將供試的28份咖啡材料全部區(qū)分開。但從單條RAPD引物的聚類分析顯示，10條多態(tài)性較好的引物中只有引物S8能將所有供試材料一次性區(qū)分開，10條引物檢測(cè)效率如表3。引物S8的多態(tài)性帶數(shù)是12條，多態(tài)性百分率100%，品種最大相似性系數(shù)為0.916 7，品種聚類區(qū)分率為100%，為最有效的引物。其次為引物S11、S19，品種最大相似性系數(shù)為1，品種聚類區(qū)分率為53.57%，有13個(gè)品種無(wú)法區(qū)分開。僅用引物S8就能將所有參試品種有效區(qū)分，故選用S8的分子數(shù)據(jù)用于咖啡種質(zhì)資源DNA 指紋圖譜的構(gòu)建。

利用草料二維碼在線生成器對(duì)所有供試材料進(jìn)行編碼，為每份材料建立了1個(gè)DNA 指紋圖譜編碼，其中包含了所屬種類、種質(zhì)名稱、采樣地點(diǎn)、引物、RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)以及電泳圖片，從而得到二維碼結(jié)果。如圖2-A為印度，包含以下信息：所屬種類大粒種，種質(zhì)名稱印度、采樣地點(diǎn)德宏所、引物S8、RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)為000000011100，以及圖2-A電泳圖；圖2-B為巴西，包含以下信息：所屬種類小粒種，種質(zhì)名稱為巴西，采樣地點(diǎn)為熱經(jīng)所，引物S8，RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)為000000001110，電泳圖2-B；圖2-C為印度，包含信息，種類為中粒種，種質(zhì)名稱為興28，采樣地點(diǎn)為香飲所，引物S8，RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)為110001000110，電泳圖2-C。28份咖啡資源的RAPD數(shù)據(jù)見表3。

3 討論

任何一種分子標(biāo)記在實(shí)際運(yùn)用中都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)易受多種因素的影響，因其利用的是非特異引物，擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性是相對(duì)的。但可通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索建立適合該物種的一套反應(yīng)條件，得到令人滿意的擴(kuò)增結(jié)果[19-21]。

本研究所用的咖啡RAPD反應(yīng)體系及程序等都經(jīng)本課題組反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出的最優(yōu)反應(yīng)條件。從研究結(jié)果可看出，同一條引物在各個(gè)咖啡樣品間和不同引物在相同的咖啡樣品上多態(tài)性帶數(shù)和擴(kuò)增總帶數(shù)的差異較顯著，說(shuō)明供試的基因組DNA多態(tài)性較豐富，也表明了RAPD標(biāo)記是研究咖啡種質(zhì)資源親緣關(guān)系和構(gòu)建咖啡指紋圖譜的有效方法。

本研究篩選出的10條RAPD引物對(duì)28份咖啡材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出86條帶，平均每條引物擴(kuò)增出8.6條帶，多態(tài)性條帶共74條，占總數(shù)的86%，相似性系數(shù)變幅為0.337 8～0.905 4，多樣性較豐富，這與此次試驗(yàn)的選材也有一定關(guān)系，收集的28份咖啡樣品為生產(chǎn)或科學(xué)研究上具有代表性的咖啡品種（品系），涵蓋了咖啡屬的4個(gè)種，其中小粒種和中粒種居多，大粒種和查理種因其抗逆性較好，目前在科學(xué)研究中較多用于作砧木。

為了降低成本和提高樣品的檢測(cè)效率，在構(gòu)建DNA指紋圖譜時(shí)，原則之一就是利用較少的引物分開盡量多的品種，這就意味著所用的引物多態(tài)性和穩(wěn)定性要好。10條引物中，S8多態(tài)性條帶12條，多態(tài)性百分率為100%，品種聚類區(qū)分率100%。因此，選擇引物S8構(gòu)建DNA指紋圖譜。若在試驗(yàn)材料增加時(shí)，單條引物不能區(qū)分所有供試材料，可在引物S8的基礎(chǔ)上增加多態(tài)性較好的引物，如S11、S19，利用引物組合區(qū)分出所有品種[22]。

DNA指紋代碼構(gòu)建指紋圖譜的信息有限，而二維碼技術(shù)可進(jìn)行信息數(shù)據(jù)錄入。本文首次將DNA指紋代碼結(jié)合二維碼技術(shù)應(yīng)用在咖啡研究中，從而生成咖啡二維碼，可更方便快捷地供研究人員進(jìn)行對(duì)比和鑒定，為建立咖啡的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)提供直觀有效的數(shù)據(jù)支持。最終產(chǎn)生的信息也可錄入到咖啡產(chǎn)品的物流信息中，從而形成一條完整的咖啡產(chǎn)品物流信息鏈，為咖啡產(chǎn)品在市場(chǎng)上的健康持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1] Amidou N D， Michel N， Serge H， et al. Genetic basis of species differentiation between Coffea liberica Hiem and C. canephora Pierre： Analysis of an intempecific cross[J].Genet Resour Crop Evol，2007， 54： 1 011-1 021.

[2] Aggarwal R K， Hendre P S，Varshney R K， et al. Identification， characterization and utilization of EST-derived genic microsatellite markers for genome analyses of coffee and related species[J]. Theor Appl Genet， 2007， 114： 359-372.

[3] A1-Arequi AHNA， Chliyeh M， Sghir F， et al. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosphere of Coffea Arabica in the Republic of Yemen[J]. J App1 Biosci， 2013， 64： 4 888-4 901.

[4] Carrera F， Leon-Camacho M， Pablos F， et al. Authentication of green coffee varieties according to their sterolic profile[J]. Anal Chim Acta， 1998， 370： 131-139.

[5] Martin M J， Pablos F， Gonzalez A G， et al. Fatty acid profiles as discriminant parameters for coffee varieties differentiation[J]. Talanta，2001， 54： 291-297.

[6] Jham G N， Winkler J K， Berhow M A， et al. γ-Tocopherol as a marker of Brazilian coffee（Coffea arabica L.）adulteration by corn[J]. J Agric Food Chem，2007， 55： 5 995-5 999.

[7] 薛建峰，譚美蓮，嚴(yán)明芳，等. 我國(guó)部分蓖麻品種遺傳資源SSR分析及DNA指紋圖譜[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2015，37（1）：048-054.

[8] 聶新輝，尤春源，李曉方，等. 新陸早棉花品種DNA 指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，2014，40（12）：2 104-2 117.

[9] 汪 斌，祁 偉，蘭 濤，等. 應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記繪制紅麻種質(zhì)資源DNA指紋圖譜[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（6）：1 116-1 123.

[10] 郭菊卉，田 娟，石桃雄，等. 甜蕎重組自交系（RIL）親本基因組RAPD標(biāo)記的多樣性分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（2）：284-288.

[11] 王紅意，翟 紅，王玉萍，等. 30個(gè)中國(guó)甘薯主栽品種的RAPD指紋圖譜構(gòu)建及遺傳變異分析[J]. 分子植物育種，2009，7（5）：879-884.

[12] 龐 敏，鄒芳平，肖婭萍. 應(yīng)用RAPD技術(shù)構(gòu)建絞股藍(lán)DNA指紋圖譜[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，34（3）：87-91.

[13] 王曉陽(yáng)，董云萍，黃麗芳，等. 利用SSR分子標(biāo)記快速鑒別中粒種與小粒種咖啡[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2014，35（4）：622-627.

[14] 黃麗芳，董云萍，王曉陽(yáng)，等. 利用RAPD標(biāo)記分析咖啡種質(zhì)資源的遺傳多樣性[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2014，35（12）：2313-2319.

[15] 黃麗芳，閆 林，董云萍，等. 咖啡葉片DNA提取方法的比較研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，31（12）：42-45.

[16] 閆 林，黃麗芳，譚樂(lè)和，等. 咖啡ISSR與RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2012，33（5）：854-859.

[17] 劉本英，孫雪梅，李友勇，等. 20個(gè)云南無(wú)性系茶樹良種的DNA指紋圖譜構(gòu)建[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（4）：720-727.

[18] 宋海斌，崔西波，欒非時(shí)，等. 基于SSR標(biāo)記的甜瓜品種（系）DNA指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（13）：2676-2689.

[19] 楊青松，熊 勇，趙 艷，等. 血滿草RAPD-PCR反應(yīng)體系的建立與DNA指紋圖譜研究[J]. 生物技術(shù)，2014，24（5）：48-51.

[20] 呂 雪. 李屬種質(zhì)資源的RAPD指紋圖譜分析[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[21] 熊華斌，吳渝生，程在全. 云南省3種作物品種RAPD指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 種子，2004，23（2）：10-13.

[22] 馬瑞君，梅洪娟，莊東紅，等. 不同品種（系）鳳凰單叢茶DNA指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 茶葉科學(xué)，2014，34（5）：515-524.