黃麗芳　董云萍　王曉陽　孫燕　陳鵬　林興軍　閆林

摘 要 選用4份咖啡種質(zhì)資源為材料，對S1-S100共100個RAPD引物進行篩選，選出多態(tài)性好的引物10個。利用這10個RAPD引物對28份咖啡資源進行擴增，共獲得86條帶，平均每個RAPD引物擴增出8.6條帶，多態(tài)性譜帶74條，多態(tài)性條帶比率為86.0%。結(jié)果表明：供試咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富；10個多態(tài)性好的RAPD引物中S8的鑒別效率最高，能將全部供試材料全部區(qū)分開，通過整合軟件錄入如所屬種類、種質(zhì)名稱、采樣地點、引物、RAPD-PCR 擴增數(shù)據(jù)以及電泳圖片等相關(guān)信息，形成指紋圖譜二維編碼，構(gòu)成咖啡種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜，為咖啡種質(zhì)資源品種權(quán)益保護及分子身份證構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 咖啡 ；種質(zhì)資源 ；RAPD ；指紋圖譜

中圖分類號 TS273 文獻標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.008

咖啡（Coffea spp.）為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）多年生常綠灌木或小喬木，原產(chǎn)非洲北部和中部的熱帶地區(qū)?？Х葘僦参锛s有100多個種，通常所指的咖啡為小粒種、中粒種、大粒種和查理種。目前全世界馴化栽培的主要有小粒種（C. arabica L.）和中粒種（C. canephora Pierre），面積約占70%和30%[1-3]。小粒種咖啡為異源四倍體種，自花授粉，而其他種均為二倍體，異花授粉。實際生產(chǎn)中，咖啡生產(chǎn)者在來源或者遺傳背景不甚明了的情況下進行雜交或嫁接，以及地域間的引種利用等造成咖啡品種品系良莠不齊，變異性大，產(chǎn)生了大量的同物異名和同名異物，導(dǎo)致種子、種苗市場混亂的局面，阻礙咖啡產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。傳統(tǒng)的咖啡品種真實性和純度是通過形態(tài)學(xué)、化學(xué)物質(zhì)含量分析或者進行杯品等方法鑒定的[4-6]，耗時長、成本高、較難做到準(zhǔn)確鑒別咖啡品種基因型。因此，對咖啡的核心種質(zhì)的構(gòu)建、種質(zhì)的分類及真?zhèn)舞b定、品種權(quán)益保護等方面的研究顯得十分必要。

DNA指紋圖譜（DNA fingerprint）是鑒別不同品種、品系和不同無性系、不同基因型，以及辨別親本與雜交后代遺傳相關(guān)等方面的有力工具[7-9]，RAPD標(biāo)記是以PCR為基礎(chǔ)，采用隨機引物對未知序列的DNA進行檢測，根據(jù)擴增的多態(tài)性來反映基因組DNA相應(yīng)區(qū)域的遺傳關(guān)系，具有實驗操作流程簡單、所需儀器設(shè)備少、快速簡便，通用性好，且無須事先知道目的DNA片斷序列信息等許多優(yōu)點，在生物的遺傳多樣性檢測、品系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛運用[10-12]。

近年來，咖啡的分子標(biāo)記研究也取得了一些進展。王曉陽等[13]從514對SSR引物中篩選出1對特異性引物進行中小粒種咖啡的鑒定。該引物在小粒種中可擴增出雙帶，在中粒種中擴增出單帶，從擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)目即可進行中小?？Х鹊蔫b別。黃麗芳等[14]用篩選獲得的18條RAPD多態(tài)性引物對72份咖啡種質(zhì)資源進行RAPD擴增，結(jié)果表明，咖啡資源在種的分類水平上存在遺傳關(guān)系多樣性，部分資源的分類學(xué)地位與地理來源無相關(guān)性。本文利用RAPD標(biāo)記技術(shù)，對28份咖啡資源進行遺傳多樣性分析，并篩選出穩(wěn)定的，多態(tài)性好的RAPD引物，構(gòu)建DNA指紋圖譜，為咖啡資源的分子身份證構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為28份咖啡種質(zhì)資源，其中大粒及查理種咖啡5份（編號1～5），小粒種咖啡10份（編號6～15），中粒種咖啡13份（編號16～28）。材料采自于海南，云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（簡稱德宏所），云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所（簡稱熱經(jīng)所），中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所（簡稱香飲所）。詳見表1。

1.2 基因組DNA的提取

采用CTAB改良法進行咖啡葉片基因組DNA的提取[15]。提取的DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測質(zhì)量，稀釋至20 ng/μL，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選及RAPD擴增

利用4份差異較大的咖啡模板，對RAPD引物S1-S100共100條隨機引物進行多態(tài)性篩選，從中選取多態(tài)性好且擴增條帶清晰的對實驗樣品進行擴增。引物由上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為本課題組優(yōu)化過的咖啡RAPD反應(yīng)體系[16]：20 μL體系中，含ddH2O 13.75 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.6 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.2 μL，引物（10 μmol/L）1.2 μL，Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，基因組DNA（20 ng/μL）1 μL。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，38℃退火1 min 45 s，72℃延伸2 min，反應(yīng)40個循環(huán)；72℃再延伸7 min。擴增產(chǎn)物通過1.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察，以DL 2 000 Marker為參照，試驗重復(fù)2次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴增引物的遷移率，利用人工方法統(tǒng)計讀帶，將清晰度高、重復(fù)性好的擴增條帶賦值“1”，無條帶或肉眼分辨不清的弱帶賦值“0”，導(dǎo)入Excel 表格生成數(shù)據(jù)矩陣。通過多態(tài)性條帶比率、品種最大相似系數(shù)及品種聚類區(qū)分率（Rate of distinguishing variety by cluster，RDVC）鑒別引物。采用NTSYSpc 2.1軟件，根據(jù)Nei和Li相似系數(shù)計算遺傳相似性GS（genetic similarity），根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進行聚類分析。RDVC=（N-Ni）/N，Ni 為無法區(qū)分品種數(shù)，N為品種總數(shù)。

1.5 指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)RAPD電泳擴增結(jié)果，從多態(tài)性比較豐富的引物中選出至少一條可將所有供試品種區(qū)分且表現(xiàn)優(yōu)異的RAPD引物，構(gòu)建咖啡品種（系）的DNA指紋圖譜?？Х鹊腄NA指紋圖譜一部分是RAPD擴增數(shù)據(jù)，由二進制代碼組成，另一部分是結(jié)合草料二維碼在線生成器（www.cli.im）將咖啡的種質(zhì)名稱、種屬、采樣地點、引物名稱、RAPD數(shù)據(jù)代碼[17]，RAPD-PCR擴增數(shù)據(jù)圖片等信息錄入軟件中，形成指紋圖譜二維編碼[18]，可以更加快捷方便的進行實際應(yīng)用。詳見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD引物篩選與擴增片段多態(tài)性

以4份差異較大的咖啡基因組DNA為模板，對S1-S100共100個RAPD引物進行多態(tài)性篩選，篩選出10個多態(tài)性較好的引物。利用這10個引物對28份材料基因組DNA進行PCR擴增，擴增出的位點多態(tài)性數(shù)目為5～12條，產(chǎn)物片段大小介于350～2 000 bp ，以引物S8和S19擴增的位點數(shù)最多，10個引物共擴增出86個位點，平均每個引物擴增出8.6條譜帶，其中多態(tài)性帶74條，多態(tài)性條帶比例為86.0%，其中S8引物多態(tài)性最為豐富。詳見表3。

2.2 聚類分析

28份咖啡材料間的相似性系數(shù)變幅為0.337 8～0.905 4。其中小粒種喀麥隆（13）和中粒種熱研2 號（17）的相似系數(shù)最小，為0.337 8，說明二者間的遺傳距離最遠，遺傳差異最大。小粒種CCC24（8）和鐵畢卡（11），中粒種興32（24）和興30（26）相似系數(shù)最大，都為0.905 4，表明它們之間的遺傳距離最小，遺傳差異最小。從種內(nèi)遺傳相似系數(shù)看，2份大粒種的相似系數(shù)為0.635 1，查理種種內(nèi)最小相似系數(shù)為查理中果（4）和查理大果（5），為0.702 7，最大相似系數(shù)為查理小果（3）和查理大果（5），為0.878 4。小粒種CATIMOR P88（7）和巴布亞新幾內(nèi)亞（14），中粒種興32（24）和興31（25），它們種內(nèi)最小相似系數(shù)分別為0.662 2和0.608 1。

UPGMA 聚類結(jié)果（圖1）分析，該聚類圖在相似性系數(shù)為0.608水平下可劃分為3大類。第Ⅰ類群包括5份材料，包括2份大粒種和3份查理種，第Ⅱ類群包括全部13份中粒種材料，第Ⅲ類群包括了全部的小粒種。聚類分析結(jié)果表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3大類群種間關(guān)系清晰，聚類結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果一致。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)10條引物擴增譜帶的多態(tài)性，能將供試的28份咖啡材料全部區(qū)分開。但從單條RAPD引物的聚類分析顯示，10條多態(tài)性較好的引物中只有引物S8能將所有供試材料一次性區(qū)分開，10條引物檢測效率如表3。引物S8的多態(tài)性帶數(shù)是12條，多態(tài)性百分率100%，品種最大相似性系數(shù)為0.916 7，品種聚類區(qū)分率為100%，為最有效的引物。其次為引物S11、S19，品種最大相似性系數(shù)為1，品種聚類區(qū)分率為53.57%，有13個品種無法區(qū)分開。僅用引物S8就能將所有參試品種有效區(qū)分，故選用S8的分子數(shù)據(jù)用于咖啡種質(zhì)資源DNA 指紋圖譜的構(gòu)建。

利用草料二維碼在線生成器對所有供試材料進行編碼，為每份材料建立了1個DNA 指紋圖譜編碼，其中包含了所屬種類、種質(zhì)名稱、采樣地點、引物、RAPD-PCR擴增數(shù)據(jù)以及電泳圖片，從而得到二維碼結(jié)果。如圖2-A為印度，包含以下信息：所屬種類大粒種，種質(zhì)名稱印度、采樣地點德宏所、引物S8、RAPD-PCR擴增數(shù)據(jù)為000000011100，以及圖2-A電泳圖；圖2-B為巴西，包含以下信息：所屬種類小粒種，種質(zhì)名稱為巴西，采樣地點為熱經(jīng)所，引物S8，RAPD-PCR擴增數(shù)據(jù)為000000001110，電泳圖2-B；圖2-C為印度，包含信息，種類為中粒種，種質(zhì)名稱為興28，采樣地點為香飲所，引物S8，RAPD-PCR擴增數(shù)據(jù)為110001000110，電泳圖2-C。28份咖啡資源的RAPD數(shù)據(jù)見表3。

3 討論

任何一種分子標(biāo)記在實際運用中都有各自的優(yōu)缺點。RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)易受多種因素的影響，因其利用的是非特異引物，擴增結(jié)果的穩(wěn)定性是相對的。但可通過多次實驗摸索建立適合該物種的一套反應(yīng)條件，得到令人滿意的擴增結(jié)果[19-21]。

本研究所用的咖啡RAPD反應(yīng)體系及程序等都經(jīng)本課題組反復(fù)多次實驗驗證，篩選出的最優(yōu)反應(yīng)條件。從研究結(jié)果可看出，同一條引物在各個咖啡樣品間和不同引物在相同的咖啡樣品上多態(tài)性帶數(shù)和擴增總帶數(shù)的差異較顯著，說明供試的基因組DNA多態(tài)性較豐富，也表明了RAPD標(biāo)記是研究咖啡種質(zhì)資源親緣關(guān)系和構(gòu)建咖啡指紋圖譜的有效方法。

本研究篩選出的10條RAPD引物對28份咖啡材料進行PCR擴增，共擴增出86條帶，平均每條引物擴增出8.6條帶，多態(tài)性條帶共74條，占總數(shù)的86%，相似性系數(shù)變幅為0.337 8～0.905 4，多樣性較豐富，這與此次試驗的選材也有一定關(guān)系，收集的28份咖啡樣品為生產(chǎn)或科學(xué)研究上具有代表性的咖啡品種（品系），涵蓋了咖啡屬的4個種，其中小粒種和中粒種居多，大粒種和查理種因其抗逆性較好，目前在科學(xué)研究中較多用于作砧木。

為了降低成本和提高樣品的檢測效率，在構(gòu)建DNA指紋圖譜時，原則之一就是利用較少的引物分開盡量多的品種，這就意味著所用的引物多態(tài)性和穩(wěn)定性要好。10條引物中，S8多態(tài)性條帶12條，多態(tài)性百分率為100%，品種聚類區(qū)分率100%。因此，選擇引物S8構(gòu)建DNA指紋圖譜。若在試驗材料增加時，單條引物不能區(qū)分所有供試材料，可在引物S8的基礎(chǔ)上增加多態(tài)性較好的引物，如S11、S19，利用引物組合區(qū)分出所有品種[22]。

DNA指紋代碼構(gòu)建指紋圖譜的信息有限，而二維碼技術(shù)可進行信息數(shù)據(jù)錄入。本文首次將DNA指紋代碼結(jié)合二維碼技術(shù)應(yīng)用在咖啡研究中，從而生成咖啡二維碼，可更方便快捷地供研究人員進行對比和鑒定，為建立咖啡的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫提供直觀有效的數(shù)據(jù)支持。最終產(chǎn)生的信息也可錄入到咖啡產(chǎn)品的物流信息中，從而形成一條完整的咖啡產(chǎn)品物流信息鏈，為咖啡產(chǎn)品在市場上的健康持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持。

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