王家禎 ， 耿昕穎 ， 董文龍 ， 單曉楓 ， 高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林長春130118)

3株殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗

王家禎 ， 耿昕穎 ， 董文龍 ， 單曉楓 ， 高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林長春130118)

為研究草魚、鰱魚感染細菌性疾病及臨床合理用藥提供理論依據(jù)，從草魚、鰱魚脾臟分離3株優(yōu)勢菌分別進行人工感染、生化鑒定、16S rRNA基因序列分析及藥敏試驗。結(jié)果表明，3株優(yōu)勢菌均為革蘭染色陰性桿菌，人工感染試驗證實均為致病菌。11種藥物敏感試驗表明，3株分離菌均對氟苯尼考敏感，而對紅霉素、阿奇霉素、強力霉素、磺胺間甲氧嘧啶、環(huán)丙沙星耐藥。該結(jié)果可為研究魚類殺鮭氣單胞菌的鑒定及預(yù)防魚類細菌性疾病提供依據(jù)。

殺鮭氣單胞菌 ； 16S rRNA ； MIC藥敏試驗

殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)是氣單胞菌屬氣單胞菌科的革蘭陰性短桿菌，廣泛分布于世界各地，主要引起鮭魚科魚類的“癤瘡病”、“敗血癥”[1]、造成魚體嚴重潰爛，但隨著人們不斷深化研究發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌也可侵染其他魚類，并且可與其他氣單胞菌屬混合感染，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。近年來，由于水體惡化，密集飼養(yǎng)等問題導(dǎo)致鰱魚在養(yǎng)殖過程中遭受危害。本試驗從病魚體內(nèi)分離純化3株優(yōu)勢菌并對其進行了理化特性和分子生物學(xué)特性及耐藥性分析。以期為治療淡水魚的細菌性疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病死魚采自長春某水產(chǎn)市場。死亡草魚體質(zhì)量50 g左右，鰱魚體質(zhì)量100 g左右。鰱魚癥狀表現(xiàn)為體表鱗片大量脫落，頭部眼底和尾部有出血點，草魚腹部有腹水，剖檢均發(fā)現(xiàn)脾臟發(fā)黑、腸道有出血點。

1.2 主要試劑 TSA瓊脂，購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細菌微量生化反應(yīng)管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司，11種抗生素均購自北京海洋醫(yī)藥化工生物科技有限公司。

1.3 細菌的分離 取發(fā)病癥狀明顯的草魚和鰱魚，在無菌條件下采集脾臟，劃線接種于TSA瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等。進行革蘭染色，觀察細菌形態(tài)特征，得到3株優(yōu)勢菌分別命名為LBY1507、LHY1507 、CQY1412。

1.4 人工感染試驗 將健康草魚(50±5 g)10條/組，一組為對照組，注射無菌生理鹽水，0.2 mL/條；其余組均為感染組，分別注射CQY1412、LBY1507、LHY1507三株優(yōu)勢菌的2×105、2×106、2×107、2×108CFU/mL細菌懸液，0.2 mL/條。以上各組均于23 ℃獨立隔離飼養(yǎng)7 d，觀察草魚發(fā)病情況。計算CQY1412、LBY1507、LHY1507半數(shù)致死量(LD50)，將各組發(fā)病明顯的草魚在無菌條件下分離再培養(yǎng)，并比較分離菌株和攻毒菌株的理化特征。

1.5 生理生化鑒定 將菌株CQY1412、LBY1507、LHY1507分別在無菌條件下穿刺接種于細菌生化鑒定管中，對其進行動力性等檢測，參照微量生化反應(yīng)說明書及伯杰氏細菌鑒定手冊[2]方法鑒定純化菌。1.6 16S rRNA基因PCR擴增 分別在無菌條件下將菌株CQY1412、LBY1507、LHY1507接種于TSB液體培養(yǎng)基中，180 r/min 28 ℃震搖24 h，提取細菌總DNA，作為PCR反應(yīng)模板進行擴增，轉(zhuǎn)至E.coliDH5-α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.7 系統(tǒng)進化樹分析 3株分離菌株的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中BLAST軟件進行比對，應(yīng)用MAGA6.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.8 藥敏試驗 將菌液密度分別稀釋至106CFU/mL，11種抗生素采用肉湯微量稀釋法對分離菌株的最小抑菌濃度[3]進行測定。每株分離菌進行3次重復(fù)試驗。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài) 分離純化后的3株菌,菌落表面濕潤微凸，邊緣光滑呈黃白色圓形，革蘭染色為陰性，短桿狀兩側(cè)鈍圓。

2.2 人工感染試驗結(jié)果 結(jié)果如表1所示，3株分離菌均對健康草魚有不同程度的致病性，菌株CQY1412、LBY1507、LHY1507的半數(shù)致死量LD50為：1.07×107、5.31×106、1.06×106CFU/mL。人工感染的發(fā)病草魚均表現(xiàn)癥狀為腹部、眼底有出血點，肛門紅腫。與自然感染發(fā)病魚一致，由此可證明3株分離菌均存在致病性。

2.3 生理生化試驗結(jié)果 3株菌為無動力細菌，硫化氫、蘋果酸、檸檬酸、己二酸、苯乙酸、甘油試驗均為陰性，甲基紅、吲哚、氧化酶、甘露糖、半乳糖試驗為陽性。CQY1412菌株不能使蔗糖、乳糖發(fā)酵，尿素及V-P試驗為陽性，而LBY1507 、LHY1507菌株使葡萄糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可初步確定為殺鮭氣單胞菌。

表1 分離株對草魚人工感染試驗結(jié)果

2.4 16S rRNA基因擴增結(jié)果 如圖1所示，PCR擴增CQY1412、LBY1507、LHY1507 3株菌的16S rRNA基因片段約為1 510 bp經(jīng)人工校對得到序列為1 450 bp，采用BLAST軟件進行同源性比對，3株分離菌與殺鮭氣單胞菌核苷酸同源性在98%～99%之間。

圖1 16S rRNA PCR 擴增結(jié)果

M：DL-2 000 Marker; 1:CQY141206 16S rRNA PCR 產(chǎn)物； 2：LBY150705 16S rRNA PCR 產(chǎn)物； 3：LHY150701 16S rRNA PCR 產(chǎn)物

2.5 系統(tǒng)進化分析 如圖2所示，從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中選取不同亞種殺鮭氣單胞菌16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進化樹。LBY150705、LHY150701分別與殺鮭氣單胞菌無色亞種菌株登錄號AY910844.1、KC244777.1在同一分支，而CQY141206則與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種菌株登錄號AB680803.1聚在同一分支上。這3株菌與氣單胞菌屬其他種間親緣關(guān)系較遠，綜合常規(guī)生理生化和16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明，菌株LBY150705、LHY150701為殺鮭氣單胞菌無色亞種，而CQY141206為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。

2.6 藥敏試驗結(jié)果 如表2所示，CQY141206只對阿米卡星和氟苯尼考較為敏感。LBY150705對恩諾沙星、阿米卡星、氯霉素、氟苯尼考、慶大霉素較為敏感。LHY150701則只對氯霉素、氟苯尼考、慶大霉素敏感。

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

3 討論

殺鮭氣單胞菌主要存在于海水、淡水中，是魚類癤病的主要誘因，在傳統(tǒng)觀念里殺鮭氣單胞菌主要感染鮭科魚，但目前人們發(fā)現(xiàn)，也可感染非魚類。本試驗中草魚及鰱魚都存在體表側(cè)鱗片脫落，眼底出血點，嚴重者出現(xiàn)潰瘍灶。從草魚和鰱魚體內(nèi)分離出的3株優(yōu)勢菌進行人工感染試驗，3株菌都具有較強的致病性，且人工感染癥狀與自然感染癥狀一致。菌株LHY1507、 LBY1507的理化性質(zhì)相同與殺鮭氣單胞菌的無色亞種相同，而菌株CQY1412則與殺鮭亞種相同。為更加準確的鑒別菌株CQY1412、LHY1507、 LBY1507的亞種，將3株菌的16S rRNA基因序列與GenBank登錄的殺鮭氣單胞菌無色亞種和殺鮭氣單胞菌比對，其一致性均達到98%以上，將不同種屬氣單胞菌與3株優(yōu)勢菌構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)LHY1507、 LBY1507與不同的無色亞種在一分支上，而CQY1412與殺鮭亞種在一分支上，結(jié)合理化試驗結(jié)果，進一步說明菌株LHY1507、 LBY1507為殺鮭氣單胞菌無色亞種，CQY1412株為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。國外報道中多數(shù)氣單胞菌屬對氨芐青霉素、萬古霉素、青霉素、克林霉素等均有不同程度耐藥[4-5],對氟喹諾酮類藥物高度敏感。同時對于鮭鱒魚類感染殺鮭氣單胞菌的防治，已經(jīng)開發(fā)出相關(guān)的滅活疫苗[6]。而我國目前仍以投放抗生素為主要的治療手段。本試驗進行的藥敏試驗表明，3株菌對氟苯尼考均高度敏感，除CQY1412株只對于阿米卡星較敏感外，但是對于其他藥物均有不同程度耐藥這與美洲紅點鮭源[7]的殺鮭亞種菌株耐藥譜不盡相同，推測與環(huán)境和抗生素使用有關(guān)。菌株LHY1507、 LBY1507對氯霉素和慶大霉素都高度敏感，LBY1507株對阿米卡星和恩諾沙星較敏感，而LHY1507對慶大霉素較敏感，此結(jié)果可以為白鰱、草魚養(yǎng)殖過程中患出血癥提供早期的預(yù)防依據(jù)。但國內(nèi)已報到的大西洋鮭魚無色亞種菌BH1352[8]對慶大霉素耐藥，而對強力霉素較為敏感，這與LBY1507、 LHY1507菌株的藥物敏感情況略有差異。本試驗為進一步研究殺鮭氣單胞菌的致病性及耐藥性提供理論依據(jù)，同時也對于殺鮭氣單胞菌的防治應(yīng)更科學(xué)用藥，避免盲目用藥導(dǎo)致病原菌的耐藥性，逐步減少抗生素藥物的使用。

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Isolated,Identification and antibiotic resistance analysis of threeAeromonassalmonicida

WANG Jia-zhen , GENG Xin-ying ，DONG Wen-long ，SHAN Xiao-feng , GAO Yun-hang

(College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118,China)

The research was aimed to study the reasonable drug application for the infected bacterial diseases ofCtenopharyngodonidellaandSilvercarps, in the clinic.The pathogens were isolated from spleens of diseasedsilvercarpsandC.idellus.They were donfinned to be the pathogens of the disease by artificial infection experiments,biochemical identification,16 srRNA gene sequence analysis and drug sensitivity test.The results showed that the isolated strains were pathogenic Gram-negative bacterium.The 11 durgs sensitive test indicated that all isolates were sensitive toFlorfenicol, resistant toErythrocin，Azithromycin，Doxycycline,Sulfamerazine,andCiprofloxacin.It will offer references for rapid identification ofAeromonassalmonicidaand treatment of the fish disease.

Aeromonassalmonicida;16S rRNA;MIC drug susceptibility test

GAO Yun-hang

；2015-11-16

吉林省重點科技攻關(guān)項目(20150204065NY)

王家禎(1991- )，女，碩士生，研究方向為動物疫病防治，E-mail：496006960@qq.com

高云航 E-mail：gaoyunhang@163.com

S941.4

A

0529-6005(2017)02-0078-03