韋柳青，邰振國(guó)，賀 銀，張淑云，戴麗敏，劉媛媛

（廣西揚(yáng)翔豬病檢測(cè)中心，廣西 貴港 537100）

廣西豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行株的分子流行病學(xué)調(diào)查及防控策略

韋柳青，邰振國(guó)，賀 銀，張淑云，戴麗敏，劉媛媛

（廣西揚(yáng)翔豬病檢測(cè)中心，廣西 貴港 537100）

為了解廣西地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）流行毒株的遺傳變異情況和發(fā)展趨勢(shì)，通過(guò)RT-PCR方法，對(duì)2015年1-8月份采自廣西省各規(guī)模豬場(chǎng)的疑似樣品進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性病料進(jìn)行基因測(cè)序分析。結(jié)果顯示：84份疑似樣品中有40份檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為47.6%，通過(guò)完整的ORF5基因序列遺傳進(jìn)化分析表明，廣西地區(qū)流行毒株主要為美洲型PRRSV，且均與高致病性PRRSV高度同源。廣西省各規(guī)模豬場(chǎng)毒株與2015年7月份采自廣東肇慶某規(guī)模豬場(chǎng)的PRRSV分離毒株間的同源性均較低，經(jīng)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，廣東肇慶分離毒株與美洲流行毒株NADC 30高度同源。結(jié)果表明，廣西地區(qū)主要流行毒株為美洲型高致病性PRRSV毒株，且與美洲流行毒株NADC30同源性較低，但廣東地區(qū)已出現(xiàn)美洲流行毒株NADC30，提示廣西地區(qū)需加強(qiáng)對(duì)PRRSV流行及變異的監(jiān)測(cè)，以及采取有效防控策略的必要性。

豬繁殖與呼吸綜合征；NADC30；系統(tǒng)進(jìn)化分析；防控

1987年，豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等、仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道疾病為主要特征，是一種急性、高度傳染性的疾病，以前曾稱為神秘病、藍(lán)耳病等，是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的病毒性疾病之一，現(xiàn)已呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬只買賣移動(dòng)、飼養(yǎng)密度過(guò)大、飼養(yǎng)管理及衛(wèi)生條件不良、氣候變化等，均可促發(fā)該病的流行。我國(guó)于1996年首次報(bào)道該病毒的存在，隨后流行于全國(guó)。豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的，該病毒的特點(diǎn)是高頻率的突變和病毒重組，導(dǎo)致了病毒顯著的進(jìn)化和不同類型病毒的產(chǎn)生。目前PRRSV主要包括以VR2332毒株為代表的美洲型和以Lelystad virus（LV）為代表的歐洲型，這兩種基因型的核苷酸序列大約有40%的差異性，我國(guó)大陸流行的病毒株主要為美洲型PRRSV。

PRRSV NADC30是2008年從美國(guó)愛(ài)荷華州暴發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病的豬群中分離出來(lái)的毒株，毒力較強(qiáng)，豬感染NADC30后快速產(chǎn)生病毒血癥，其表現(xiàn)為早期高燒和顯著的呼吸系統(tǒng)疾病。在我國(guó)，周峰等通過(guò)RT-PCR方法，首次從2012-2013年采自河南省各地的疑似病料中檢測(cè)到與美洲流行毒株NADC30高度同源的病毒株，說(shuō)明PRRSV NADC30毒株已經(jīng)傳入我國(guó)。隨后我國(guó)多地有PRRSV NADC30毒株流行的報(bào)道，2015年該毒株將進(jìn)一步擴(kuò)散和蔓延，如果不提前采取有效的防控策略，無(wú)疑還會(huì)有不少豬場(chǎng)受到感染而引發(fā)更為嚴(yán)重的疫情。我國(guó)PRRSV的變異種類更加多樣化，提示加強(qiáng)對(duì)PRRSV流行及變異的監(jiān)測(cè)十分必要。本研究主要對(duì)2015年1-8月采自廣西各規(guī)模豬場(chǎng)的84份PRRSV疑似病料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性樣品的的ORF5基因進(jìn)行序列擴(kuò)增與分析，研究廣西地區(qū)ORF5基因變異的情況和發(fā)展趨勢(shì)，為PRRS的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集廣西省貴港市、河池市、玉林市、南寧市等地各規(guī)模豬場(chǎng)疑似PRRSV陽(yáng)性病豬的脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等臟器以及發(fā)燒豬的血液樣品，共84份。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑（Rnase Inhibitor）、Rrizol Reagent及瓊脂糖，均購(gòu)自Invitrogen公司；dNTP、2*Taq PCR Master Mix及DNase/RNase-free去離子水，均購(gòu)自北京天根公司。

表1 ORF5基因的特異性引物

表2 參考毒株

表3 檢測(cè)到的用于ORF5基因序列分析的18株P(guān)RRSV廣西毒株

圖1 18株P(guān)RRSV廣西毒株與參考毒株之間的ORF5基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株CH-1a株和已發(fā)表的HUN株全基因序列，應(yīng)用Oligo 6.0生物軟件，在ORF5基因前后保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增ORF5基因的特異性引物E1/E2（表1），引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.4 樣品中PRRSV的診斷和ORF5基因的序列分析

對(duì)樣品進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理后，參照病毒RNA抽提試劑盒說(shuō)明書提取樣品中的RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

利用DNAStar軟件中的MegAlign程序?qū)z測(cè)到的部分病毒含量較高的陽(yáng)性樣品的PRRSV毒株與參考毒株（表2）進(jìn)行ORF5基因的序列比對(duì)、同源性分析及遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV的診斷結(jié)果

對(duì)2015年1—8月份采自廣西各規(guī)模豬場(chǎng)的84份PRRSV疑似病料進(jìn)行PRRSV RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果檢出PRRSV陽(yáng)性樣品40份，陽(yáng)性率為47.6%。

2.2 ORF5 基因序列的擴(kuò)增

選取18份病毒含量較高的陽(yáng)性樣品（表3），再次進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度為738 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送基因測(cè)序公司進(jìn)行純化測(cè)序。

2.3 ORF5基因的核苷酸序列同源性分析

ORF5基因的核苷酸序列同源性分析顯示，18株P(guān)RRSV廣西毒株之間的ORF5基因序列同源性為93.7%～100%，與JXA1、HuN4、BJ等中國(guó)分離的美洲型高致病性參考毒株之間的ORF5基因序列同源性為94.0%～99.7%，與VR2332、R98和CH-1a等美洲型經(jīng)典毒株之間的ORF5基因序列同源性為84.4%～95.2%，與歐洲型參考毒株Lelystad virus之間的ORF5基因序列同源性僅為61.6%～64.6%。18株廣西毒株與廣東肇慶毒株19-ZQLJQ之間的ORF5基因序列同源性僅為82.4%～86.1%；而廣東肇慶毒株19-ZQLJQ，與美洲型其他參考毒株之間的ORF5基因序列同源性僅為84.4%～86.9%，與美洲型NADC30之間的ORF5基因序列同源性高達(dá)95.4%。

2.4 PRRSV ORF5基因序列的遺傳進(jìn)化分析

ORF5基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析顯示，美洲型PRRSV可以分為3 個(gè)亞群（圖1），18株P(guān)RRSV廣西毒株與TJ、HuN4、JXA1等毒株組成亞群1；經(jīng)典毒株VR2332、CH-1a和R98組成亞群2；廣東肇慶毒株19-ZQLJQ與2008年美國(guó)毒株NADC30同屬于亞群3。廣東毒株出現(xiàn)在亞群3中，預(yù)示著廣東地區(qū)已出現(xiàn)了新的PRRSV毒株，應(yīng)當(dāng)給予高度關(guān)注。

3 討論

1987年P(guān)RRSV首次暴發(fā)于美國(guó)，1996年首次證實(shí)PRRSV在我國(guó)存在，由于沒(méi)有采取有效的防治措施，2006年夏秋季節(jié)，高致病性豬藍(lán)耳病在我國(guó)南方部分地區(qū)開(kāi)始暴發(fā)，現(xiàn)已蔓延全國(guó)。自從周峰等通過(guò)RT-PCR方法，首次從2012-2013年采自河南省各地的疑似病料中檢測(cè)到與NADC30高度同源的病毒株以來(lái)，NADC30毒株已在很多地區(qū)流行，2015年進(jìn)一步擴(kuò)散和蔓延。如不加以重視，美洲型毒株NADC30的傳入對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)來(lái)說(shuō)可能又是1次更為沉重的打擊。

本研究中采集的病料大多來(lái)自于使用高致病性PRRS弱毒活疫苗進(jìn)行免疫的豬場(chǎng)，也有少部分不接種PRRS疫苗的豬場(chǎng)。通過(guò)對(duì)豬場(chǎng)的持續(xù)檢測(cè)以及對(duì)PRRSV遺傳多樣性的靶基因-ORF5基因的序列分析，我們發(fā)現(xiàn)，豬場(chǎng)使用了PRRS弱毒活疫苗后，不能完全阻止PRRS的發(fā)生，雖然疾病的發(fā)生與豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理、免疫預(yù)防及治療等措施緊密相關(guān)，但也說(shuō)明了目前市售的疫苗依然不能很好地控制豬藍(lán)耳病的發(fā)生，PRRSV還在不斷地發(fā)生變異。

值得慶幸的是，2015年1—8月監(jiān)測(cè)到的18株P(guān)RRSV廣西毒株仍然屬于美洲型毒株，且均為高致病性毒株。18株P(guān)RRSV廣西毒株之間的ORF5基因序列同源性較高，與TJ、HuN4、JXA1等中國(guó)分離的高致病性毒株親緣關(guān)系較近，同屬亞群1，但與廣東肇慶毒株19-ZQLJQ之間的ORF5基因序列同源性僅為82.4%～86.1%。而廣東肇慶毒株19-ZQLJQ與2008年分離的美洲型NADC30毒株的ORF5基因序列同源性高達(dá)95.4%，親緣關(guān)系最近，同屬于亞群3，說(shuō)明與廣西毗鄰的廣東省已出現(xiàn)美洲型毒株NADC30的感染。廣東毒株出現(xiàn)在亞群3中，預(yù)示著廣東地區(qū)已出現(xiàn)了新的PRRSV毒株，應(yīng)當(dāng)給予高度關(guān)注，如果各豬場(chǎng)不做好充足的準(zhǔn)備，采取有效的防控策略阻止NADC30毒株的感染，后果將不堪設(shè)想。

對(duì)于PRRS的防控，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授認(rèn)為，豬場(chǎng)應(yīng)樹(shù)立綜合防控PRRS的理念，走出過(guò)分依賴疫苗的誤區(qū)，將生物安全控制措施放在首位，積極探索閉群飼養(yǎng)、毒株馴化、多點(diǎn)飼養(yǎng)等方式，建立適合自身豬場(chǎng)的綜合防控體系。養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家（如美國(guó)）也并非完全依賴于疫苗，而是積極探索行之有效的控制策略。美國(guó)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，通過(guò)采取嚴(yán)格的生物安全措施，切斷PRRSV 的傳播途徑和消滅傳染源是預(yù)防豬群感染PRRSV 的最有效措施。據(jù)悉，我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系的京安綜合試驗(yàn)站堅(jiān)持采用閉群技術(shù)控制PRRS，同時(shí)采取生物安全控制措施、后備母豬馴化、PRRSV檢測(cè)和淘汰陽(yáng)性種豬，經(jīng)過(guò)3年的工作，種豬群達(dá)到了PRRSV陰性，豬群生產(chǎn)性能穩(wěn)定。

關(guān)于高致病性PRRSV NADC30毒株的防控，楊漢春教授表示，目前市售疫苗對(duì)此毒株究竟有無(wú)保護(hù)率，尚無(wú)明確數(shù)據(jù)；而獸醫(yī)病理學(xué)博士遇秀玲女士則認(rèn)為，NADC30毒株和美國(guó)的VR2386株具有同源性，JXA1-R株活疫苗對(duì)于VR2386毒株具有很好的防控效果，因而我們養(yǎng)豬人士同樣可以用JXA1-R株活疫苗來(lái)防控高致病性NADC30毒株帶來(lái)的豬藍(lán)耳病感染。

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室調(diào)查發(fā)現(xiàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室確診為PRRSV陽(yáng)性的豬場(chǎng)，大部分均免疫過(guò)PRRS高致病性弱毒疫苗，但卻不能阻止PRRS的發(fā)生。有的豬場(chǎng)常年發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病，在沒(méi)有經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室確診病原的情況，直接選取一種PRRS疫苗進(jìn)行免疫；有的豬場(chǎng)在發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病后，免疫PRRS疫苗，免疫幾個(gè)月后覺(jué)得沒(méi)有明顯的效果，馬上停止免疫，這些豬場(chǎng)在使用疫苗方面均存在一定的盲目性和隨意性，對(duì)PRRS的防控極為不利，而且還可能引發(fā)新的毒株在豬場(chǎng)流行。

豬場(chǎng)任何疾病的發(fā)生均與飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境消毒衛(wèi)生、飼養(yǎng)密度、免疫預(yù)防措施以及發(fā)病隔離機(jī)制等息息相關(guān)，單純依靠疫苗來(lái)控制PRRS難以奏效，必須采取綜合防控的措施。如果豬場(chǎng)沒(méi)有免疫過(guò)PRRS疫苗，可將生物安全控制措施放在首位，積極探索閉群飼養(yǎng)、毒株馴化、多點(diǎn)飼養(yǎng)等方式，建立適合自身豬場(chǎng)的綜合防控體系。如果豬場(chǎng)一直在免疫PRRS疫苗，可堅(jiān)持使用，但不能高頻次免疫，以免造成疫苗毒株的擴(kuò)散。使用疫苗前必須先檢測(cè)本豬場(chǎng)PRRSV毒株的類型，做ORF5基因的序列分析，確定與哪種疫苗毒株的同源性和親緣關(guān)系最接近，才能使用該種疫苗毒株進(jìn)行免疫。當(dāng)豬場(chǎng)發(fā)生明顯的發(fā)燒和呼吸系統(tǒng)疾病，懷疑是PRRS時(shí)，首先必須采取綜合防控措施，控制疾病的傳播，同時(shí)采樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并做ORF5基因的序列分析，確定感染的PRRSV毒株的類型，才能確定最終的防控方案。如果豬場(chǎng)感染了NADV30毒株，首先應(yīng)采取綜合防控措施，并適當(dāng)進(jìn)行清群，如果豬場(chǎng)一直免疫的是JXA1-R株活疫苗，可繼續(xù)使用?？傊?，不管是何種毒株引起的PRRS，其防控原則均為：綜合防控措施為主，疫苗為輔，且疫苗需謹(jǐn)慎使用。

2016-06-01）