崔 迪，張楊珩，張 婷，魏挺力，閆福華*

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科，2.牙體牙髓科，3.口腔種植科，江蘇 南京 210008)

兩種利用micro-CT測(cè)量小鼠牙周炎模型牙槽骨吸收的方法比較

崔 迪1，張楊珩1，張 婷2，魏挺力3，閆福華1*

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科，2.牙體牙髓科，3.口腔種植科，江蘇 南京 210008)

目的 比較兩種利用微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT)測(cè)量小鼠牙周炎模型牙槽骨吸收的方法。方法 結(jié)扎小鼠右側(cè)上頜第二磨牙建立牙周炎模型，分離其右側(cè)上頜骨后進(jìn)行micro-CT掃描。由3名醫(yī)師分別采用重建法(R法)和改良的斷層測(cè)量法(T法)進(jìn)行牙槽骨測(cè)量，分析比較兩種測(cè)量方法的一致性和穩(wěn)定性。結(jié)果 不同測(cè)量者采用R法進(jìn)行測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為35.67 μm，采用T法的SD為14.24 μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同一測(cè)量者采用R法測(cè)量3次所得結(jié)果之間的SD為34.87 μm，采用T法的SD為7.82 μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 采用T法測(cè)量小鼠牙周炎模型牙槽骨吸收的一致性和穩(wěn)定性均優(yōu)于R法。

牙槽骨吸收；牙周炎；體層攝影術(shù)，X線計(jì)算機(jī)

圖1 測(cè)量方法 A.測(cè)量位點(diǎn)； B.以R法測(cè)量各位點(diǎn)的CEJ-ABC； C.CT示小鼠上頜骨的冠狀位(紅色)、軸位(綠色)、矢狀位(藍(lán)色)； D.小鼠牙體長(zhǎng)軸與y軸(紅線)平行； E.牙合面近遠(yuǎn)中長(zhǎng)軸與x軸(藍(lán)線)平行； F.牙合面與z軸(綠線)平行； G.于冠狀位測(cè)量某一位點(diǎn)的CEJ-ABC(兩平行黃線之間的垂直距離)

牙槽骨吸收是牙周炎的典型病理改變，也是判定患牙愈后的重要依據(jù)之一[1]。目前測(cè)量牙槽骨吸收的方法主要包括組織病理形態(tài)學(xué)計(jì)量法[2]、亞甲基藍(lán)硬組織染色法[3-4]、X線投照法[5]和CT三維重建[6]測(cè)量法。其中，組織病理形態(tài)學(xué)計(jì)量法為金標(biāo)準(zhǔn)[7]，CT測(cè)量結(jié)果與病理結(jié)果高度一致，是目前評(píng)價(jià)骨組織結(jié)構(gòu)較常用的方法[8]。近十年來(lái)，微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro computed tomography， micro-CT)因其分辨率高、操作簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)，可提供三維信息等優(yōu)勢(shì)，在牙周炎相關(guān)研究中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[9]。目前應(yīng)用micro-CT測(cè)量牙槽骨吸收的研究大多由于各種原因，對(duì)測(cè)量時(shí)頜骨位置的選擇并未明確闡述，導(dǎo)致結(jié)果可能存在較大誤差。本研究建立小鼠牙周炎模型并進(jìn)行micro-CT分析，對(duì)常用的重建法(R法)與本研究改良的斷層測(cè)量法(T法)進(jìn)行比較，以期為micro-CT測(cè)量牙槽骨吸收的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型與分組 取12只9周齡健康C57BL/6雄性小鼠(北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量17～22 g，平均(20.1±1.3)g。參照Ma等[10]的方法，于全麻(戊巴比妥75 mg/kg體質(zhì)量、硫酸阿托品1.875 mg/kg體質(zhì)量)下，以5-0絲線結(jié)扎小鼠右側(cè)上頜第二磨牙(M2)，將絲線置于齦溝內(nèi)。而后將所有小鼠飼養(yǎng)于恒溫[(23.0±1.0)°]恒濕[(60.0±5.0)%]且12 h晝夜循環(huán)照明的環(huán)境下，自由進(jìn)食、飲水，隔天檢查絲線，如絲線脫落則將該小鼠剔除實(shí)驗(yàn)。分別于結(jié)扎后當(dāng)日(A組)、3天(B組)、7天(C組)、28天(D組)隨機(jī)處死3只小鼠，分離右側(cè)上頜骨，以4%多聚甲醛固定24 h。

1.2micro-CT圖像采集 采用Bruker SkyScan 1172型micro-CT掃描儀對(duì)各組小鼠上頜骨標(biāo)本進(jìn)行掃描。掃描時(shí)將標(biāo)本置于泡沫塑膠管內(nèi)，保持牙長(zhǎng)軸與掃描平面平行。掃描參數(shù)：360°旋轉(zhuǎn)，管電壓50 kV，管電流445 μA，X線暴露時(shí)間265 ms，掃描層厚18 μm。通過(guò)NReconstruction重建獲得三維圖像。

1.3 測(cè)量方法 由3名牙周專(zhuān)業(yè)醫(yī)師盲法采用R法及T法對(duì)各組進(jìn)行獨(dú)立測(cè)量。每1名測(cè)量者分別采用兩種方法各測(cè)量3次，每次測(cè)量間隔1天。

1.3.1 R法 采用Miyajima等[11]的方法，通過(guò)SkyScan CTvox v.3.1.1軟件調(diào)整圖像位置，保存BMP格式的二維圖像，并導(dǎo)入image-pro-plus 6.0軟件進(jìn)行測(cè)量。以釉牙骨質(zhì)界(cement-to-enamel junction， CEJ)至牙槽嵴頂(alveolar bone crest， ABC)的距離(CEJ-ABC)作為牙槽骨吸收的參考標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)小鼠上頜3顆磨牙(M1、M2、M3)的18個(gè)位點(diǎn)(頰側(cè)、腭側(cè)各9個(gè))進(jìn)行測(cè)量[12]，分別為M1：近頰/腭尖(mesio-buccal/palatal cusp， MBC or MPC)、頰/腭溝(buccal/palatal groove，BG or PG)、遠(yuǎn)頰/腭尖(disto-buccal/palatal cusp， DBC or DPC)、遠(yuǎn)頰/腭溝(disto-buccal/palatal groove， DBG or DPG)和遠(yuǎn)中牙尖(distal cusp， DC)；M2：近頰/腭尖(mesio-buccal/palatal cusp， MBC or MPC)、頰/腭溝(buccal/palatal groove， BG or PG)和遠(yuǎn)頰/腭尖(disto-buccal/palatal cusp， DBC or DPC)；M3：頰/腭尖(buccal/palatal cusp， BC or PC)，見(jiàn)圖1。

圖2 不同測(cè)量方法的準(zhǔn)確性 (*：與采用R法產(chǎn)生的SD相比，P<0.05) 圖3 結(jié)扎時(shí)間對(duì)準(zhǔn)確性的影響 (*：與采用R法產(chǎn)生的SD相比，P<0.05) 圖4 測(cè)量位點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)確性的影響 (*：與采用R法產(chǎn)生的SD相比，P<0.05) A.頰側(cè)； B.腭側(cè)

1.3.2 T法 通過(guò)Dataviewer軟件分析斷層圖像，將M2牙體長(zhǎng)軸與y軸平行，牙合面近遠(yuǎn)中向長(zhǎng)軸與x軸平行，牙合面與z軸平行。測(cè)量某位點(diǎn)的CEJ-ABC時(shí)，使y軸通過(guò)該位點(diǎn)，并在該面測(cè)量該處的CEJ-ABC，見(jiàn)圖1。

1.4 誤差分析 采用標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation， SD)評(píng)價(jià)不同測(cè)量者間及同一測(cè)量者的誤差。分析不同測(cè)量者間采用同一測(cè)量方法的誤差時(shí)，取每名測(cè)量者3次測(cè)量中第1次的測(cè)量結(jié)果。

1.5 牙槽骨吸收情況 對(duì)不同結(jié)扎時(shí)間各組(A～D組)小鼠牙槽骨吸收情況進(jìn)行分析時(shí)，取3名測(cè)量者采用兩種方法測(cè)量的平均值作為該組的測(cè)量值，觀察牙槽骨隨時(shí)間的變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(正態(tài)分布)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)(非正態(tài)分布)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性分析 3名測(cè)量者采用同一種測(cè)量方法時(shí)，R法的SD為35.67 μm，T法的SD為14.24 μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。同一測(cè)量者采用不同測(cè)量方法前后3次測(cè)量時(shí)，R法SD為34.87 μm，T法的SD為7.82 μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)

2.2 結(jié)扎時(shí)間對(duì)準(zhǔn)確性的影響 不同結(jié)扎時(shí)間各組不同測(cè)量者采用T法測(cè)量時(shí)SD分別為：A組6.06 μm，B組17.42 μm，C組12.39 μm，D組21.11 μm；采用R法測(cè)量時(shí)SD分別為：A組25.45 μm，B組33.47 μm，C組38.80 μm，D組44.96 μm。不同結(jié)扎時(shí)間各組同一測(cè)量者采用T法測(cè)量時(shí)SD分別為：A組6.23 μm，B組8.21 μm，C組9.40 μm，D組7.46 μm；采用R法測(cè)量時(shí)SD分別為：A組24.09 μm，B組32.78 μm，C組38.67 μm，D組43.93 μm。不同結(jié)扎時(shí)間各組不同測(cè)量者間和同一測(cè)量者內(nèi)SD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，圖3)。

2.3 測(cè)量位點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)確性的影響 在頰側(cè)，除外M1的BG位點(diǎn)、M2的DBC位點(diǎn)及M3的BG位點(diǎn)，其余各位點(diǎn)不同測(cè)量者采用T法測(cè)量的SD均較采用R法更小(P均<0.05，圖4A)；在腭側(cè)，M1的MPC位點(diǎn)及M2和M3的所有位點(diǎn)，不同測(cè)量者采用T法測(cè)量的SD均較采用R法更小(P均<0.05，圖4B)。同一測(cè)量者進(jìn)行測(cè)量時(shí)，頰側(cè)及腭側(cè)各位點(diǎn)除頰側(cè)M1的MBC位點(diǎn)外，采用T法測(cè)量的SD均小于R法 (P均<0.05，圖4)。

2.4牙槽骨吸收隨時(shí)間的變化 結(jié)扎3天時(shí)，即發(fā)生牙槽骨吸收，且隨結(jié)扎時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，見(jiàn)圖5。

3 討論

曾有學(xué)者[13-15]截取牙槽骨的某一截面，在該面上測(cè)量CEJ-ABC，此方法為“斷層法”。但其中多數(shù)研究未明確上頜骨的測(cè)量位置。有研究[13-14]嘗試調(diào)整圖像使M1、M2、M3的CEJ與根尖孔處于同一平面進(jìn)行測(cè)量，此方法具有一定的可行性，但由于牙根形態(tài)和根尖孔位置的不規(guī)則和變異性，實(shí)際操作存在困難，誤差可能較大。此外，重度牙周炎牙齒移位時(shí)，難以使3顆牙的根尖孔處在同一平面。因此，建立一種既不受解剖形態(tài)的限制，也不會(huì)受牙齒移位影響的測(cè)量方法十分必要。本研究中T法選取的標(biāo)志是目標(biāo)牙的牙合面近遠(yuǎn)中向長(zhǎng)軸、牙長(zhǎng)軸和牙合面，這3個(gè)標(biāo)志不受某個(gè)牙尖、溝、嵴、根尖孔等解剖結(jié)構(gòu)變異的限制，也不受牙齒移位的影響。

表1 不同測(cè)量方法之間的比較

圖5 結(jié)扎后當(dāng)日(A組)、3天(B組)、7天(C組)、28天(D組)不同位點(diǎn)的牙槽骨高度 A.結(jié)扎不同時(shí)間后上頜骨3D重建圖像，比例尺為500 μm； B、C.結(jié)扎不同時(shí)間采用T法測(cè)量頰側(cè)(B)及腭側(cè)(C)各位點(diǎn)的牙槽骨高度

本研究對(duì)比R法與T法在測(cè)量牙槽骨吸收上的可靠性，發(fā)現(xiàn)T法的操作者間誤差更小，且同一測(cè)量者使用T法測(cè)量時(shí)產(chǎn)生的誤差也明顯小于R法，表明T法測(cè)量結(jié)果的一致性更高、誤差更小，也更為可靠。此外，本研究發(fā)現(xiàn)T法的測(cè)量結(jié)果普遍小于R法，可能因?yàn)檠乐苎籽啦酃枪敲芏冉档停?D圖像中與周邊骨組織及牙體組織重疊，不夠清晰，測(cè)量者無(wú)法準(zhǔn)確判斷ABC，導(dǎo)致測(cè)量值大于實(shí)際值，而斷層圖像不存在以上問(wèn)題。

R法的誤差來(lái)源可能包括4個(gè)方面：①無(wú)明確的頜骨位置參考線，解剖結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致樣本位置不完全一致；②硬組織密度十分接近，CEJ和ABC不清晰；③透視效果導(dǎo)致“遠(yuǎn)小近大”；④測(cè)量時(shí)需要進(jìn)行比例尺以及像素和長(zhǎng)度單位的轉(zhuǎn)換，易產(chǎn)生誤差。而T法的誤差來(lái)源主要是CT掃描層厚的限制，層厚越薄，測(cè)量值越接近實(shí)際值。此外，T法相對(duì)于R法有其明顯的優(yōu)勢(shì)，R法只能測(cè)量物體表面“看得見(jiàn)”的結(jié)構(gòu)，而T法可以深入物體內(nèi)部，測(cè)量那些“看不見(jiàn)”的結(jié)構(gòu)，如鄰間隙處的CEJ-ABC，根分叉處ABC至根分叉穹頂?shù)木嚯x等。重度牙周炎牙齒移位時(shí)，R法中一些位點(diǎn)被遮擋，無(wú)法測(cè)量，T法可以隨時(shí)調(diào)整，以適應(yīng)牙齒位置的變化。R法與T法的比較見(jiàn)表1。

綜上所述，本組小鼠牙周炎模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明T法相對(duì)于R法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可操作性更強(qiáng)，測(cè)量結(jié)果一致性和穩(wěn)定性更好。

[1] Lei L, Li H, Yan F, et al. Hyperlipidemia impaired innate immune response to periodontal pathogen porphyromonas gingivalis in apolipoprotein E knockout mice. PloS One, 2013,8(8):e71849.

[2] Van Dyke TE, Hasturk H, Kantarci A, et al. Proresolving nanomedicines activate bone regeneration in periodontitis. J Dent Res, 2015,94(1):148-156.

[3] Kim MH, Choi YY, Lee HJ, et al. Topical application of herbal formula for the treatment of ligature-induced periodontitis. J Periodontal Implant Sci, 2015,45(4):145-151.

[4] Azambuja CB, Cavagni J, Wagner MC, et al. Correlation analysis of alveolar bone loss in buccal/palatal and proximal surfaces in rats. Brazilian oral research, 2012,26(6): 571-577.

[5] Wang Y, Chai Z, Zhang Y, et al. Influence of low-intensity pulsed ultrasound on osteogenic tissue regeneration in a periodontal injury model: X-ray image alterations assessed by micro-computed tomography. Ultrasonics, 2014,54(6):1581-1584.

[6] Soboku K, Kikuchi T, Fujita S, et al. Altered gene expression in gingival tissues and enhanced bone loss in rats with diabetes with experimental periodontitis. J Periodontol, 2014,85(3):455-464.

[7] 鄧婕,鐘曉波,萬(wàn)朝霞,等.CBCT評(píng)價(jià)下頜第一恒磨牙牙冠硬組織厚度增齡性變化.中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2016,32(2):223-226.

[8] Particelli F, Mecozzi L, Beraudi A, et al. A comparison between micro-CT and histology for the evaluation of cortical bone: Effect of polymethylmethacrylate embedding on structural parameters. J Microsc-Oxford, 2012,245(3):302-310.

[9] Li X, Wu X, Ma Y, et al. Oral administration of 5-hydroxytryptophan aggravated periodontitis-induced alveolar bone loss in rats. Arch Oral Biol, 2015,60(5):789-798.

[10] Ma S, Guo J, You X, et al. Expressions of interleukin-1beta and interleukin-6 within aortas and uteri of rats with various severities of ligature-induced periodontitis. Inflammation, 2011,34(4):260-268.

[11] Miyajima S, Naruse K, Kobayashi Y, et al. Periodontitis-activated monocytes/macrophages cause aortic inflammation. Sci Rep, 2014,4:5171.

[12] Abe T, Hajishengallis G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods, 2013,394(1-2):49-54.

[13] 徐菁玲,李偉力.錐型束CT在牙周手術(shù)中的應(yīng)用進(jìn)展.中國(guó)介入影像與治療學(xué),2013,10(12):768-771.

[15] Maekawa T, Takahashi N, Tabeta K, et al. Chronic oral infection with porphyromonas gingivalis accelerates atheroma formation by shifting the lipid profile. PloS One, 2011,6(5):e20240.

Assessment of two methods in evaluating alveolar bone loss by micro-CT based on periodontitis model in mice

CUIDi1,ZHANGYangheng1,ZHANGTing2,WEITingli3,YANFuhua1*

(1.DepartmentofPeriodontology, 2.DepartmentofEndodontics, 3.DepartmentofOralImplant,NanjingStomatologicalHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity,Nanjing210008,China)

Objective To evaluate two methods measuring alveolar bone loss by micro computed tomography (micro-CT) based on periodontitis model in mice. Methods The silk ligatures were tied around the right maxillary second molars of mice to induce periodontitis model. The right half maxillaries of mice model were harvested for micro-CT analysis. Three dentists were recruited for the measurement with two different methods： Modified tomography (T) method and reconstruction (R) method. Accuracy and consistency of each method were estimated by standard deviation (SD). Results The SDs of R method managed by the same operator (measurement for 3 times) or different operators (3 operators) were 34.87 μm and 35.67 μm respectively, while that of T method was 7.82 μm and 14.24 μm respectively. The SDs of T method were significantly lower than those of R method (bothP<0.05). Conclusion T method is more accurate and consistent than R method for evaluating alveolar bone loss in mice periodontitis model.

Alveolar bone loss; Periodontitis; Tomography， X-ray computed

國(guó)家自然科學(xué)基金(81570982、81371152)、江蘇省雙創(chuàng)計(jì)劃引進(jìn)人才[蘇人才辦(2014)27]、江蘇特聘醫(yī)學(xué)專(zhuān)家資助項(xiàng)目[蘇衛(wèi)人(2014)49號(hào)]。

崔迪(1989—)，女，江蘇無(wú)錫人，碩士，醫(yī)師。研究方向：牙周病和全身疾病關(guān)系。E-mail: cd_nju@163.com

閆福華，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科，210008。E-mail: fhyan2005@126.com

2016-07-30

2017-01-08

R816.98； 814.42

A

1672-8475(2017)03-0173-05

10.13929/j.1672-8475.201607059