閆亭亭，龍晨，蔡文武，王繼龍

（1． 中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院，湖南 長沙410008；2． 中南大學湘雅二醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙410011）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型[1]，其發(fā)病率和病死率分別位居全球惡性腫瘤的第5位和第2位[2-3]。手術(shù)切除和肝移植是早期肝癌目前最常見的根治手段[4-5]。但由于術(shù)后較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，HCC患者預(yù)后依然較差[6]，術(shù)后5年生存率只有24%～50%，甚至更低[7-9]。因此，尋找能夠用于預(yù)后預(yù)測和治療的分子標志物依然是當前HCC研究的熱點和難點。

FK506結(jié)合蛋白5（FK506 binding protein 5，F(xiàn)KBP5），又稱FKBP51（FK506 binding protein 51），是親免素蛋白家族成員之一[10]，具有調(diào)節(jié)多種生物學過程的作用，如免疫調(diào)節(jié)、類固醇激素受體活化、細胞生存、蛋白質(zhì)合成、折疊和運輸?shù)萚11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP5在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要作用[12]。FKBP5在黑色素細胞瘤[13]、前列腺癌[14-15]、食管腺癌[16]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[17]等腫瘤組織中呈高表達，且與細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥等密切相關(guān)。但也有文獻[18]顯示FKBP5在胰腺癌組織中呈低表達。這提示FKBP5在不同腫瘤中的表達具有組織特異性。目前，尚無文獻報道FKBP5在HCC組織中的表達情況。本研究擬采用qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學方法，檢測FKBP5在HCC組織中的表達情況，并分析其與HCC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為正確評估HCC生物學行為和預(yù)后提供有用指標。

1　材料與方法

1.1　臨床標本

隨機選取中南大學湘雅二醫(yī)院2009年5月—2011年1月期間接受手術(shù)切除的HCC患者的石蠟標本107例，包括HCC組織及相應(yīng)癌旁組織，且經(jīng)病理學檢查確診。所有患者均具有完整的臨床病理資料（表1），術(shù)前未進行放、化療等輔助治療。隨訪的方式主要采取定期復(fù)查及電話隨訪，隨訪截止于2015年10月，中位隨訪時間為35（2.0～75.0）個月。另收集30對HCC及相應(yīng)的癌旁非腫瘤肝組織（距腫瘤＞2cm）新鮮標本，在手術(shù)切除后立即取樣，分別裝入凍存管中，迅速冷凍于液氮并于-80℃冰箱中保存。本研究由中南大學湘雅二醫(yī)院倫理委員會審核批準，并經(jīng)過研究對象或其家屬知情同意。

1.2　試劑

RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，qRT-PCR反應(yīng)試劑盒購自TaKaRa生物技術(shù)公司，引物合成由上海生工生物公司完成，F(xiàn)KBP5引物序列上游：TTT GAC TGC AGA GAT GTG GC，下游：CCT GCC TCT CCA AAA CCA TA；內(nèi)參GAPDH引物序列上游：GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G，下游：ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A。RIPA裂解液購自北京康為世紀生物公司，BCA蛋白定量分析試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，PVDF膜購自美國Milipore公司，ECL試劑盒購自江蘇碧云天公司。FKBP5一抗為兔抗人多克隆抗體（Santa Cruz），WB工作液濃度1:100，IHC工作液濃度1:50。β-actin一抗為鼠抗人單克隆抗體（Sigma），WB工作液濃度1:1 000。免疫組織化學二步法檢測試劑盒（PV-9000）、進口山羊血清工作液和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。

1.3　方法

1.3.1qRT-PCR 取新鮮組織50 mg，采用TRIzol法抽提總RNA，按照Takara試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在7300 Real Time PCR System（美國Applied Biosystems公司）上進行熒光實時定量PCR，設(shè)置好反應(yīng)條件后啟動PCR反應(yīng)，具體條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，分別記錄FKBP5和GAPDH的Ct（Cycle threshold）值，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算FKBP5在HCC組織中的相對表達水平。

1.3.2蛋白質(zhì)提取和Western blot檢測 研磨好的新鮮HCC及癌旁組織用RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣品混合上樣緩沖液后100 ℃變性10 min，取50 μg總蛋白上樣，以10%SDS-PAGE膠電泳分離后經(jīng)電轉(zhuǎn)移槽濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉30 min；PBST漂洗3次后將PVDF膜置入FKBP5或β-actin一抗，4 ℃過夜；PBST洗膜10 min×3次，置入1:10 000稀釋的HRP標記的相應(yīng)二抗（中杉金橋生物公司）室溫孵育30 min，再次PBST洗滌后ECL化學發(fā)光法顯影、定影，曝光攝片。以β-actin為內(nèi)參。

1.3.3免疫組織化學染色及結(jié)果判定 4 μm厚的石蠟組織切片于65 ℃下烤片30 min，二甲苯脫蠟15 min×2次，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)，生物標記筆進行組織圈定后滴加3%過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS浸泡3min×3次；山羊封閉血清室溫封閉30 min，加一抗工作液4 ℃過夜；PBS浸泡3 min×3次，滴加即用型二抗，室溫孵育1 h；PBS浸泡3 min×3次，DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片，最后將切片置于顯微鏡下觀察并拍照。用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：采用雙盲法閱片，每張切片選取5個高倍鏡視野，根據(jù)細胞核陽性顯色百分比進行評分[19]。＜5%細胞核顯色為0分；5%～30%細胞核顯色為1分；31%～50%細胞核顯色為2分；＞50細胞核顯色為3分。其中，0～1分定義為低表達，2～3分定義為高表達。

1.4　統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩個樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，F(xiàn)KBP5蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗，單因素及多因素生存分析采用Cox比例風險回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié) 果

2.1　FKBP5在HCC組織和癌旁組織中的表達

采用qRT-PCR法檢測30例HCC及相應(yīng)癌旁組織中FKBP5 mRNA表達水平，結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，F(xiàn)KBP5 mRNA在26例HCC組織中呈高表達，占86.7%（26/30）（圖1A）。與qRT-PCR結(jié)果相似，Western blot結(jié)果表明FKBP5蛋白在HCC組織中的表達明顯高于相應(yīng)癌旁組織，典型的Western blot圖片見圖1B。

為進一步明確FKBP5蛋白在HCC組織中的表達情況，采用免疫組化法檢測107例HCC及相應(yīng)癌旁組織石蠟切片中FKBP5蛋白的表達水平。FKBP5蛋白主要定位于細胞核，且與癌旁組織相比，F(xiàn)KBP5在HCC組織中表達明顯增高（圖1C-D）。FKBP5蛋白在86.0%（92/107）的HCC組織中有表達，根據(jù)免疫組化結(jié)果評分標準，將HCC組織標本分為FKBP5高表達組和低表達組。其中高表達組占63.6%（68/107），低表達組占36.4%（39/107）；而癌旁組織中FKBP5高表達者僅有30例（28.0%），其高表達率明顯低于HCC組織（P＜0.001）（圖1E）。

2.2　FKBP5蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

分析FKBP5蛋白表達水平與107例HCC患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP5表達水平與腫瘤大?。≒=0.009）、數(shù)量（P=0.018）、微血管侵犯（P=0.020）、TNM分期（P=0.009）以及BCLC分期（P=0.024）有關(guān)，而與患者性別、年齡、AFP、HBsAg、肝硬化、包膜、Edmondson-Steiner分級等無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

2.3　FKBP5表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

圖1　FKBP5在HCC及癌旁組織中的表達檢測 A：qRT-PCR檢測FKBP5 mRNA表達；B：Western blot檢測FKBP5蛋白表達；C：FKBP5在HCC及癌旁組織中的免疫組化染色；D：FKBP5不同表達強度的HCC組織；E：FKBP5在107例HCC及相應(yīng)癌旁組織中的表達差異比較Figure 1 Determination of FKBP5 expression in HCC tissues and adjacent non-tumorous tissues A: FKBP5 mRNA expression quantified by qRT-PCR; B: FKBP5 protein expression detected Western blot analysis; C: Immunohistochemical staining for FKBP5 expression in HCC and adjacent non-tumorous tissues; D: HCC tissues with different FKBP5 expression levels; E: Comparison of FKBP5 expression levels between HCC tissue and adjacent tissue non-tumorous tissues

采用Kaplan-Meier生存分析探討FKBP5表達水平與HCC患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示FKBP5高表達及低表達患者的中位生存時間分別為22.0、48.1個月，F(xiàn)KBP5高表達患者1、3、5年總體生存率分別為67.1%、32.0%、14.4%，明顯低于FKBP5低表達患者（89.6%、63.3%、40.7%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）（圖2A）。而FKBP5高表達及低表達患者的中位無瘤生存時間分別為15.7 和38.0個月，且FKBP5高表達患者1、3、5年無瘤生存率亦明顯低于FKBP5低表達患者（57.6% vs. 76.9%、23.1% vs.51.4%、9.5%vs.32.7%，P＜0.001）（圖2B）。

表1　FKBP5表達水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of FKBP5 expression with clinicopathologic characteristics of HCC patients [n (%)]

圖2　FKBP5不同表達水平的HCC患者生存情況比較 A：總體生存曲線；B：無瘤生存曲線Figure 2 Comparison of survival conditions between HCC patients with different FKBP5 expression levels A: Overall survival curves; B: Disease-free survival curves

2.4　FKBP5高表達是HCC患者總體生存和無瘤生存的獨立危險因素

利用Cox比例風險模型進行單、多因素分析，結(jié)果顯示FKBP5高表達的HCC患者死亡（HR=1.992，95% CI=1.127～3.522，P=0.018）或復(fù)發(fā)（HR=1.787，95% CI=1.067～2.992，P=0.027）風險明顯高于FKBP5低表達患者；且FKBP5高表達與肝硬化、腫瘤個數(shù)、微血管侵犯既是HCC患者總體生存的獨立危險因素，也是術(shù)后無瘤生存的獨立危險因素（均P＜0.05）（表2）。

表2　HCC患者總體生存和無瘤生存的影響因素分析Table 2 Analysis of influential factors for overall survival and disease-free survival of HCC patients

3　討 論

FKBP5是一個大小為51 kDa的FK506結(jié)合蛋白，屬于親免素家族，參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程。近年來，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益受到關(guān)注。FKBP5在前列腺癌中能夠調(diào)節(jié)雄激素受體活性，進而促進前列腺癌發(fā)生發(fā)展[14]。在黑色素細胞瘤中，F(xiàn)KBP5呈高表達，且與細胞生存、化療耐藥密切相關(guān)[20-21]。同時，F(xiàn)KBP5能夠激活EMT相關(guān)基因，維持黑色素瘤細胞干性特征，促進腫瘤細胞血管生成和轉(zhuǎn)移[13,22]。Jiang等[17]研究發(fā)現(xiàn)FKBP5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，且與腫瘤分級及預(yù)后密切相關(guān)，并且FKBP5可通過激活NF-κB通路促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和化療耐藥。此外，食管癌中FKBP5亦呈高表達，且提示患者預(yù)后較差[16]。以上研究結(jié)果均提示FKBP5是一個癌基因。但Pei等[18]發(fā)現(xiàn)FKBP5在胰腺癌標本中表達下調(diào)，并導(dǎo)致Akt磷酸化增加，從而降低基因毒應(yīng)激導(dǎo)致的細胞死亡。在胰腺癌移植瘤模型中敲除FKBP5可促進腫瘤生長，增強腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥性[23]。然而，目前FKBP5在HCC中的表達情況及臨床意義尚不清楚。

本研究首先采用qRT-PCR法檢測30例新鮮HCC標本及相應(yīng)癌旁組織中FKBP5 mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC組織中FKBP5 mRNA表達水平較配對癌旁組織明顯上調(diào)。隨后Western blot結(jié)果亦證實，與癌旁組織相比，HCC組織中FKBP5蛋白表達水平顯著增高。進一步采用免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)， FKBP5蛋白主要定位于細胞核，其在HCC組織中的染色強度明顯增高。這些研究結(jié)果表明FKBP5在HCC組織中表達上調(diào)，提示其可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程，并發(fā)揮促癌作用。這與FKBP5在黑色素瘤、前列腺癌、食管腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究結(jié)果相吻合[13-17]。

為明確FKBP5在HCC中的臨床意義，進一步分析了FKBP5表達水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP5高表達與腫瘤大小、個數(shù)、微血管侵犯、TNM分期及BCLC分期均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、AFP、HBsAg、肝硬化、包膜、Edmondson-Steiner分級等無關(guān)（均P＞0.05）。既往研究[17,20]顯示，F(xiàn)KBP5具有抑制腫瘤細胞凋亡、促進增殖的作用。而本研究發(fā)現(xiàn)FKBP5高表達與腫瘤大小密切相關(guān)，腫瘤直徑≤5cm組FKBP5高表達所占比例顯著高于腫瘤直徑（71.6% vs.45.5%，P=0.009），間接表明FKBP5可能具有促進HCC細胞增殖的作用。腫瘤個數(shù)、微血管侵犯、TNM分期和BCLC分期在一定程度上可反映腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移潛能[3,24]，F(xiàn)KBP5與以上臨床病理特征具有顯著相關(guān)性，提示FKBP5具有促進HCC細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。這與Romano等[13,22]在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)FKBP5具有促進黑色素瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用相一致，但FKBP5在HCC細胞中的具體生物學作用尚需相關(guān)功能實驗驗證。

本研究重要的發(fā)現(xiàn)還包括FKBP5對HCC患者預(yù)后的預(yù)測價值。Kaplan-Meier法分析顯示FKBP5高表達患者的總體生存率和無瘤生存率較低表達FKBP5患者顯著降低。Cox回歸單因素分析表明FKBP5表達水平與患者總體生存和無瘤生存密切有關(guān)。多因素分析進一步證實FKBP5高表達是HCC患者術(shù)后總體生存和無瘤生存的獨立危險因素。這與Smith等[16]在食管腺癌中的研究結(jié)果具有相似性?；谝陨辖Y(jié)果，F(xiàn)KBP5的表達水平可用作預(yù)測HCC患者預(yù)后的分子標志物，F(xiàn)KBP5高表達提示患者的預(yù)后較差，術(shù)后復(fù)發(fā)風險高。

綜上所述，本研究首次證實FKBP5在HCC組織中表達上調(diào)，且與HCC患者臨床病理特征及不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示FKBP5在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可作為HCC患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標。后續(xù)細胞學和分子生物學研究將有助于揭開FKBP5促進HCC進展的具體作用及機制。

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