王 可，張洪梅，王 薇，謝金蓮

(長春師范大學生命科學學院，吉林長春 130032)

中性蛋白酶酶解制備花生蛋白肽的研究

王 可，張洪梅，王 薇，謝金蓮

(長春師范大學生命科學學院，吉林長春 130032)

以生花生粕作為原料，以水解度和DPPH清除率為衡量指標，選擇酶解溫度、酶解pH值、酶比底物濃度為考察因素，研究中性蛋白酶制備花生蛋白肽的酶解工藝。通過單因素實驗，對三種因素進行了擇優(yōu)選擇，在此基礎上，利用響應面實驗設計分析因素間的交互作用和最優(yōu)工藝參數(shù)。結果表明，在溫度為42 ℃，pH值為8.25，酶比底物濃度為9 %時，水解度達到最優(yōu)值46.13 %；在溫度為47.5 ℃，pH值為8.5，酶比底物濃度為9 %時，DPPH清除率達最優(yōu)值39.68 %。

花生蛋白肽；中性蛋白酶；水解度；DPPH清除率

花生蛋白相比大豆蛋白，其含脹氣因子較少，相比菜籽、棉籽蛋白，其毒性較低[1]，利用花生蛋白可以改變食品的某些加工特征，用于多種食品添加劑之中[2]?；ㄉ墒羌庸せㄉ偷母碑a品，顏色為深褐色或淡褐色，主要由種皮、外殼、碎果仁組成，因其含有豐富的植物蛋白、不飽和脂肪酸、淀粉、糖及多種維生素，被廣泛應用于飼料、釀酒、肥料之中[3-4]。然而，目前關于花生蛋白在蛋白水解物和生物活性方面的研究仍較少[5]。將花生粕中的蛋白水解物進行分解及提取，加工成相應功能性食品材料，是花生農副產物加工領域中亟待解決的問題之一[6-9]。本研究旨在從酶解工藝角度，探討花生蛋白肽的制備方式及方法，并初步探究其抗氧化能力，為花生蛋白肽的工業(yè)化生產及活性研究提供基礎數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料及試劑

生花生粕(長春長白山榨油廠)；中性蛋白酶(食品級，南寧東恒華道生物科技有限責任公司)；DPPH(分析純，德國SIGMA公司)；甲醇、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純，北京化工廠)。

1.1.2 主要儀器與設備

RT-6000酶標儀(美國雷杜公司)；BGZ-240電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；Starter-300 pH計(北京奧豪斯儀器有限公司)；DS-1高速組織搗碎機(上海精科實業(yè)有限公司)；1000 μL單道移液器(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；3-18KHS臺式冷凍離心機(德國SIGMA公司)；SE602F電子天平(長春維拖電子衡器有限公司)；85-2恒溫磁力攪拌器(常州潤華儀器有限公司)；篩網(80目，孔徑0.10 mm，浙江上虞道墟儀器篩具廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理方法

將生花生粕平鋪于實驗盤中，厚度為1 cm，預熱干燥箱，待箱內溫度達到60 ℃后，將花生粕置于干燥箱中，設置烘干時間為4 h。將烘干后的花生粕于室溫下冷卻后放入高速組織搗碎機中搗碎，設置轉速為10000 r/min，操作時間1 min。用篩網(80目0.10 mm)篩取生花生粕粉，以備酶解。

1.2.2 生花生粕的酶解方法

稱取5 g篩后生花生粕粉放入250 mL的燒杯中，加入適當蒸餾水溶解，配置成濃度為5 %的花生粕溶液，將燒杯置于恒溫水浴鍋中，用磁力攪拌器不斷攪拌花生粕溶液，控制溫度為100 ℃，加熱10 min，使蛋白質變性；溶液冷卻至一定酶解溫度(45 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃，65 ℃)，保持溫度恒定不變；使用pH計測溶液的pH值，用0.1 mol/L的NaOH調節(jié)至一定酶解pH值(7.5,8,8.5,9,9.5)，待酶解溫度和pH值穩(wěn)定后，按照一定酶比底物濃度[E]/[S](3 %，5 %，7 %，9 %，11 %)加入適量中性蛋白酶；適當添加0.1 mol/L NaOH，保持pH值恒定不變，并記錄添加量。酶解3 h后，將酶解液水浴加熱至100 ℃，滅酶10 min，冷卻至室溫后，放入離心機，設置溫度為4 ℃，轉速10000 r/min，離心10 min，取上清液，用NaOH調節(jié)pH值至7.0，獲得花生蛋白肽。

1.2.3 水解度的測定方法

水解度用于表示蛋白質水解狀態(tài)下，其肽鍵裂解的百分比，可用于研究蛋白質的酶解條件及酶解程度，本研究選用pH-stat法[10]進行測定，計算公式如下：

其中,

h：被水解的肽鍵數(shù)；

V：酸或堿的滴定量(mL)；

C：酸或堿的濃度(mol/L)；

Mp：參加水解的蛋白質總量(g)；

htot：每克蛋白質中肽鍵的克當量數(shù)(mmol/g)；

α：氨基酸的平均離解度。

1.2.4 DPPH清除率的測定方法

采用比色法對花生蛋白肽的DPPH清除率進行定量分析[11]。在酶標板中依次加入100 μL酶解液、100 μL甲醇和100 μL 0.6 mM的DPPH甲醇溶液，避光靜置30 min，用酶標儀檢測其在515 nm波長下的吸光度，記為AS，另外。用甲醇作空白，測定空白的吸光度，記為AB，DPPH清除率計算公式如下：

其中,

AB：空白的吸光度；

AS：實驗樣品的吸光度。

1.2.5 單因素實驗設計

為研究酶解的溫度(T)、酶解pH值和酶與底物濃度比([E]/[S])對中性蛋白酶酶解花生蛋白肽水解度及花生蛋白肽DPPH清除率的影響，設計單因素實驗，方案設計如表1所示。

表1 單因素實驗設計

1.2.6 響應面實驗設計

中性蛋白酶水解花生粕實驗中，需考慮到每個影響因素之間交互作用，本研究將酶解溫度、酶解pH值、酶比底物濃度作為響應值，根據單因素實驗結果，利用響應面軟件Design-Expert 8.0設計三因素三水平的響應面優(yōu)化實驗[12]，以確定最優(yōu)工藝參數(shù)，響應面實驗編碼設計如表2所示。

表2 響應面實驗設計

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 花生蛋白肽水解度單因素實驗結果

(a)溫度對花生蛋白肽DH的影響

(b)pH值對花生蛋白肽DH的影響

(c)酶比底物濃度對花生蛋白肽DH的影響

由圖1(a)可知，花生蛋白肽的DH隨著酶解溫度的升高逐漸降低，當溫度為45 ℃時，DH值最高，為22.92 %；由圖1(b)可以看出，DH隨著pH值的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，升高至8.5時，DH值達到最高，為13.35 %，而隨著pH值繼續(xù)升高，DH逐漸降低；由圖1(c)可知，DH隨著酶比底物濃度的增加亦呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當酶比底物濃度升高至7 %時，DH值達到最高，為18.45 %，隨著酶比底物濃度繼續(xù)增加，DH逐漸降低。

2.1.2 花生蛋白肽DPPH清除率單因素實驗結果

由圖2(a)可知，花生蛋白肽的DPPH清除率隨著酶解溫度的升高逐漸降低，當溫度為45 ℃時DPPH清除率最高，為33.65 %；由圖2(b)可知，DPPH清除率隨著pH值得升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當pH值升高至8.5時，DPPH清除率達到最高，為38.02 %，繼續(xù)升高pH值，DPPH清除率反而降低；由圖2(c)可知，DPPH清除率隨著酶比底物濃度的增加亦呈先升高后降低的趨勢，當酶比底物濃度升高至7 %時，DPPH清除率最高，為49.21 %，繼續(xù)增加酶比底物濃度，DPPH清除率顯著降低。

(a)溫度對花生蛋白肽DPPH清除率的影響

(b)pH值對花生蛋白肽DPPH清除率的影響

(c)酶比底物濃度對花生蛋白肽DPPH清除率的影響

2.2 響應面實驗結果分析

2.2.1 響應面數(shù)據分析

根據Design-Expert 8.0軟件設計響應面實驗，以研究所選因素對花生蛋白肽DH和DPPH清除率的綜合影響，響應面分析見表3。

表3 DH響應面的實驗分析

2.2.2 響應面3D圖分析

對表3的結果利用Design-Expert 8.0軟件進行優(yōu)化分析，得到花生蛋白肽水解度實驗回歸模型的交互作用及響應面3D圖。如圖3(a)所示，將酶比底物濃度設為0水平時，花生蛋白肽的DH隨著溫度由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而隨著pH值由-1升至1水平，表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。由圖3(b)可知，將pH值設為0水平時，花生蛋白肽的DH隨著溫度由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而隨著酶比底物濃度由-1升至1水平，表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。由圖3(c)可知，將溫度設為0水平時，花生蛋白肽的DH隨著pH值由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而隨著酶比底物濃度由-1升至1水平，表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢；而且，酶解溫度和pH值的交互作用明顯，酶解溫度和酶比底物濃度的交互作用明顯，pH值和酶比底物濃度的交互作用明顯。

(a)溫度與pH值交互作用3D圖

(b)溫度與[E]/[S]的交互作用3D圖

(c)pH與[E]/[S]的交互作用3D圖

花生蛋白肽DPPH清除率實驗回歸模型的交互作用及響應面3D圖如圖4所示。由圖4(a)可知，將酶比底物濃度設為0水平時，花生蛋白肽的DPPH清除率隨著溫度由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而隨著pH值由-1升至1水平，表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。由圖4(b)可知，將pH值設為0水平，花生蛋白肽的DPPH清除率隨著溫度由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而隨著酶比底物濃度由-1升至1水平，變化不明顯；而且，酶解溫度和pH值的交互作用明顯，酶解溫度和酶比底物濃度的交互作用明顯，pH值和酶比底物濃度的交互作用不明顯。

2.2.3 確定最優(yōu)參數(shù)

通過響應面軟件分析可知，以水解度為指標，中性蛋白酶酶解花生蛋白肽的最優(yōu)工藝參數(shù)是：溫度為42 ℃、pH為8.25、[E]/[S]為9 %，在此條件下，得到花生蛋白肽的水解度最優(yōu)，為46.13 %；以DPPH清除率為指標，最優(yōu)酶解工藝參數(shù)是：溫度為47.5 ℃、pH為8.5、[E]/[S]為9 %，在此條件下，得到花生蛋白肽的DPPH清除率最優(yōu)，為39.68 %。

3 討論

近年來研究表明，花生粕中氨基酸分布很廣，比例與動物蛋白很相似，很利于人體吸收[12]。儀凱[13]利用中性蛋白酶研究水解花生粕制備花生蛋白肽的最佳水解條件發(fā)現(xiàn)，在反應時間3 h，控制溫度44 ℃，pH為6.7，酶比底物濃度6 %時的理論水解度為7.63 %。本研究選用中性蛋白酶對花生粕進行水解度和DPPH清除率進行測試，在已知研究基礎上，優(yōu)化了水解條件，水解效果較為理想，且酶解產物花生蛋白肽表現(xiàn)出了一定的抗氧化性，經響應面實驗證實，以兩個指標衡量花生蛋白肽的最佳工藝，[E]/[S]均為9 %，但酶解溫度和pH值不同。由于DPPH清除率響應面實驗的回歸模型失擬度顯著，因此其軟件分析獲得的最優(yōu)結果低于酶比底物濃度單因素實驗的最優(yōu)結果。

(a)溫度與pH值交互作用3D圖

(b)溫度與[E]/[S]的交互作用3D圖

(c)pH與[E]/[S]的交互作用3D圖

4 結論

本文選用中性蛋白酶對生花生粕進行水解，選用水解度和DPPH清除率作為衡量指標，在單因素分析法的基礎上，采用響應面分析法對酶解條件中的不同因素進行綜合分析，獲得了最優(yōu)酶解工藝參數(shù)，實驗結果顯示，在溫度為42 ℃，pH值為8.25，酶比底物濃度為9 %時，花生蛋白肽的水解度達到最優(yōu)值46.13 %；在溫度為47.5 ℃，pH值為8.5，酶比底物濃度為9 %時，花生蛋白肽的DPPH清除率達到最優(yōu)值39.68 %。

[1]冉文波,趙晨霞,張翌楠.中性蛋白酶水解大麥蟲蛋白工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2014(24):194-197.

[2]Binsan W,Benjakul S,Visessanguan W,et al.Antioxidative activity of Mungoong, an extract paste,from the cephalothorax of white shrimp (Litopenaeus vannamei)[J].Food Chemistry,2008(1):185-193.

[3]王素雅,劉勝,鞠興榮,等.中性蛋白酶限制性水解對高溫菜籽粕蛋白功能性質的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010(1):56-59.

[4]趙晨霞,劉新華,李治龍,等.不同酶水解玉米蛋白粉制備可溶性肽最佳條件的研究[J].食品研究與開發(fā),2009(12):33-36.

[5]吳明樓,高學飛,王志耕,等.中性蛋白酶水解乳清蛋白條件的研究[J].安徽農業(yè)科學,2005(9):1672-1673.

[6]梅娜,周文明,胡曉玉,等.花生粕營養(yǎng)成分分析[J].西北農業(yè)學報,2007(3):96-99.

[7]朱新鵬.雙酶法水解米糠蛋白工藝優(yōu)化的研究[J].保鮮與加工,2012(3):29-33.

[8]王玲玲,王金水,王艷,等.中性蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的研究[J].河南工業(yè)大學學報：自然科學版,2006(1):11-14.

[9]劉新華,趙晨霞,李治龍,等.中性蛋白酶和堿性蛋白酶對玉米蛋白水解作用的研究[J].農產品加工,2008(12):58-61.

[10]Spellman D,Mcevoy E, O’Cuinn G,et al. Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: Comparison of the TNBS,OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis[J].International Dairy Journal,2003(6):447-453.

[11]王可.玉米蛋白資源高效利用開發(fā)抗氧化肽的關鍵技術研究[D].長春:吉林大學,2014.

[12]周景祥,王桂芹,余濤.蛋白酶和淀粉酶活性檢測方法探討[J].中國飼料,2001(11):23-27.

[13]儀凱,周瑞寶.中性蛋白酶水解花生粕的研究[J].中國油脂,2005(7):71-73.

Hydrolysis Preparation of Peanut Protein Peptides by Neutral Protease

WANG Ke, ZHANG Hong-mei, WANG Wei, XIE Jin-lian

(School of Life Science,Changchun Normal University, Changchun Jilin 130032, China)

In this research, the hydrolysis preparation of peanut protein peptides by neutral protease was studied, the peanut meal was used as the raw material, the degree of hydrolysis and DPPH inhibition were detected as indicators, and the enzyme digestion temperature, pH, and [E]/[S] were used as single factors. Selection of merit was analyzed in single factor experiment, and these factors interact with each other and optimal process parameters were analyzed by the response surface experiment design. The results showed that, for hydrolysis degree of peanut protein peptides experiment, the optimal parameters were: temperature of 42 ℃, pH of 8.25, [E]/[S] of 9 %, the DH could reach 46.13 %. And for DPPH inhibition experiment, the optimal parameters were: temperature of 47.5 ℃, pH of 8.5, [E]/[S] of 9 %, the DPPH inhibition could reach 39.68 %.

peanut protein peptides; neutral protease; degree of hydrolysis; DPPH inhibition

2016-11-15

王 可(1988-)，女，碩士研究生，從事營養(yǎng)及功能性食品研究。

TS201.1

A

2095-7602(2017)02-0071-07