盛文利

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣州市 510080)

·微創(chuàng)醫(yī)學(xué)技術(shù)前沿·

缺血性腦卒中亞型GWAS研究的困境和挑戰(zhàn)

盛文利

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣州市 510080)

盛文利，男，博士，博士生導(dǎo)師，現(xiàn)任廣東省神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)療質(zhì)量控制中心專家組副組長(zhǎng)。1986年在廣西醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)本科畢業(yè)，1995年獲中山醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)博士學(xué)位，2002～2003年在美國(guó)哈佛大學(xué)附屬M(fèi)cLean醫(yī)院進(jìn)修一年。從事神經(jīng)科臨床工作近30年，對(duì)神經(jīng)科常見病和多發(fā)病的診治有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，擅長(zhǎng)診治腦血管病(腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血)、眩暈(腦血管病相關(guān)性眩暈和其他類型眩暈)、腦部疾病(感染性、炎癥性和脫髓鞘疾病)、肌肉疾病(肌炎、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、肌萎縮側(cè)索硬化)和周圍神經(jīng)疾病(急性和慢性周圍神經(jīng)病變)。對(duì)腦血管病的個(gè)體化治療、重癥腦血管病的監(jiān)護(hù)、腦血管病的預(yù)防、眩暈癥的診治和預(yù)防，以及腦部疾病、肌肉和周圍神經(jīng)疾病的診治等有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。目前從事Moyamoya病/綜合征的動(dòng)物模型研究、腦卒中相關(guān)易感基因在腦卒中發(fā)病機(jī)制中的作用研究、腦卒中后的理想血壓研究、住院腦血管病患者的臨床登記和臨床資料分析，承擔(dān)國(guó)家自然科學(xué)基金、教育部博士點(diǎn)基金、廣東省自然科學(xué)基金和廣東省科技攻關(guān)基金等多個(gè)研究項(xiàng)目。2011年、2014年和2016年多次獲得國(guó)家自然科學(xué)基金的資助;曾獲衛(wèi)生部科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)和廣東省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。在SCI期刊、中華系列醫(yī)學(xué)雜志和核心期刊上以第一作者或通訊作者發(fā)表論文46篇，其中SCI論文16篇。參編《心血管危重癥監(jiān)護(hù)治療學(xué)》、《神經(jīng)遺傳病學(xué)》、《神經(jīng)病學(xué)之神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病(第19卷)》、《基因診斷與基因治療進(jìn)展》、《全科醫(yī)學(xué)臨床診斷學(xué)》等專著。

缺血性腦卒中的遺傳學(xué)研究，從較早期的候選基因研究［1～3］(candidate gene association studies)到近期的全組基因關(guān)聯(lián)研究 (genome-wide association studies，GWAS)［4～6］，帶來(lái)了海量的遺傳信息。在海量的缺血性腦卒中相關(guān)的遺傳信息中，醫(yī)務(wù)人員片段化、標(biāo)簽化式地“讀懂”了部分遺傳信息，但是，對(duì)于缺血性腦卒中這個(gè)遺傳異質(zhì)性很強(qiáng)的多基因復(fù)雜疾病，完整準(zhǔn)確地“讀懂”缺血性腦卒中的遺傳信息，尤其是能解讀和理解缺血性腦卒中各種血管病變表型的遺傳信息與血管病變病理改變的關(guān)系及其與環(huán)境因素的互相作用，尚需做出巨大的努力［7，8］。

1 早期的缺血性腦卒中候選基因的研究

較早期的缺血性腦卒中候選基因的研究［1～3］，發(fā)現(xiàn)了一批缺血性腦卒中的候選基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，不論是編碼SNPs，還是非編碼SNPs，對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能都有潛在的作用。

對(duì)這些研究結(jié)果的解讀，以及對(duì)臨床的指導(dǎo)意義在于，發(fā)現(xiàn)了“易感基因群”的多態(tài)性位點(diǎn)，攜帶這些位點(diǎn)的人群，罹患缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)較對(duì)照組增高。不僅如此，缺血性腦卒中候選基因研究的局限性也是十分明顯的:樣本量較小，病因分型少，結(jié)果的可重復(fù)性差，種族和地域的差異性大，因果關(guān)系不清，極少涉及基因與基因的互相作用以及基因與環(huán)境的相互作用等。

2 GWAS和薈萃的GWAS

GWAS和薈萃的GWAS克服了候選基因研究存在的部分局限性。首先，海量的入組病例，獲得了缺血性腦卒中相關(guān)的海量遺傳信息，改進(jìn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，結(jié)果的可重復(fù)性顯著增加［9］;其次，不斷改進(jìn)缺血性腦卒中的亞型分型方法［TOAST分型以及CCS(causative classification of stroke system)］，發(fā)現(xiàn)了基于強(qiáng)證據(jù)的缺血性腦卒中亞型的易感基因群［9～11］;最后，共享危險(xiǎn)因素、病理生理機(jī)制的動(dòng)脈粥樣硬化性疾病—冠狀動(dòng)脈疾病(coronary artery disease，CAD)和腦大動(dòng)脈病變，房顫和心源性腦卒中均發(fā)現(xiàn)了共有的易感基因［12，13］。

由于 GWAS主要檢測(cè)人群中頻率相對(duì)較高(＞5%)的SNPs，無(wú)法涵蓋復(fù)雜疾病所有的基因變異?；诎l(fā)現(xiàn)疾病的低頻SNPs或罕見變異的外顯子組測(cè)序計(jì)劃(exome sequence project)，對(duì)發(fā)現(xiàn)病因性的致病基因有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。最新的缺血性腦卒中的外顯子組測(cè)序計(jì)劃［14］，發(fā)現(xiàn)了PDE4DIP和ACOT4罕見的位于編碼區(qū)域的基因突變，說(shuō)明在既往發(fā)現(xiàn)的“易感基因”中，存在病因性(causative)的缺血性腦卒中致病基因。

3 關(guān)于缺血性腦卒中易感基因的認(rèn)識(shí)

之所以說(shuō)醫(yī)務(wù)人員片段化、標(biāo)簽化式的“讀懂”了缺血性腦卒中相關(guān)的遺傳信息，是因?yàn)閷?duì)缺血性腦卒中這個(gè)遺傳異質(zhì)性很強(qiáng)的多基因復(fù)雜疾病的認(rèn)識(shí)還很膚淺。

其一，不論是早期的候選基因研究，還是現(xiàn)今的GWAS研究，都期冀獲得精準(zhǔn)的缺血性腦卒中亞型。然而，2016年發(fā)表的最新的薈萃GWAS研究指出［11］，在納入的缺血性腦卒中患者中，有12.6%～22.3%的患者，使用 TOAST和 CCS(causative classification of stroke，CCS)兩種分型方法，分型為“未能確定病因的缺血性腦卒中”，說(shuō)明精準(zhǔn)區(qū)分缺血性腦卒中的表型面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。事實(shí)上，臨床上的缺血性腦卒中患者，更多見的是大小血管病變并存的“復(fù)合型”血管病變。

其二，任何類型的缺血性腦卒中，都是終末表型，先有血管病變(主要是心、腦、四肢動(dòng)脈)，后有缺血性腦卒中的發(fā)生。大小血管病變的病理生理過(guò)程是動(dòng)態(tài)的、漸進(jìn)的、不可逆的。動(dòng)脈壁的損害是核心，其病理改變又各有其特點(diǎn)。動(dòng)脈粥樣硬化性的大血管病變，是以脂質(zhì)代謝異常、內(nèi)膜損傷、斑塊形成最終導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄和閉塞;而腦的小動(dòng)脈病變是以動(dòng)脈的纖維素樣壞死和玻璃樣變性為主的。目前一些公開發(fā)表的候選基因的研究和GWAS的研究結(jié)果顯示，僅有小動(dòng)脈病變的易感基因PRKCH觀察了動(dòng)脈病理?yè)p害［15］。而且，發(fā)生腦血管事件時(shí)，血管的表型是終末性和復(fù)合性的，缺乏對(duì)血管表型的動(dòng)態(tài)觀察。因此，針對(duì)GWAS研究存在的不足，有學(xué)者提出需要尋找動(dòng)脈病變的中間表型(如頸動(dòng)脈斑塊、頸動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚)進(jìn)行研究［5］。事實(shí)上，中間表型是動(dòng)態(tài)的血管病變中的一環(huán)，建議進(jìn)行各種模式動(dòng)物的動(dòng)態(tài)觀察研究，以期解決目前人類腦卒中研究中存在的困難，譬如，斑馬魚的血管在幼魚時(shí)通過(guò)雙光子顯微鏡清晰可見，在幼魚及成魚時(shí)，可以通過(guò)病理獲得血管的表型病理特征［16，17］。

其三，雖然大多數(shù)的SNPs位于非編碼區(qū)，對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能的潛在作用卻值得深入。敲除缺血性腦卒中的易感基因(一氧化氮基因)的小鼠［18］，在大腦中動(dòng)脈閉塞的模型中，其梗死體積相對(duì)小，神經(jīng)功能缺損相對(duì)輕，說(shuō)明該易感基因在疾病的發(fā)生過(guò)程中具有不可或缺的作用。此外，研究顯示［19］，敲除煙霧病的易感基因rnf 213的斑馬魚，觀察到血管的狹窄和芽生血管，說(shuō)明該易感基因在疾病的病理生理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。需要特別指出的是，既往研究曾發(fā)現(xiàn) PDE4D和MTHFR基因(rs1801133)是腦卒中的易感基因［20，21］，但在不同種族人群中未能重復(fù)或者部分重復(fù)，且GWAS研究亦不支持是腦卒中的易感基因［11］，但是外顯子組測(cè)序計(jì)劃卻發(fā)現(xiàn)PDE4DIP(rs1778155)的編碼區(qū)有罕見突變［14］。而MTHFR C677T新近被證實(shí)［22］，是限于腦小動(dòng)脈病變導(dǎo)致，并經(jīng)頭顱MRI檢查確定的腔隙性腦梗死的易感基因。因此，諸多的易感基因的結(jié)構(gòu)和功能，需要在模式動(dòng)物中進(jìn)一步驗(yàn)證。

其四，心肌梗死和腦梗死的常見的共同病因之一是動(dòng)脈粥樣硬化，有共同的發(fā)病機(jī)制，共享相同的危險(xiǎn)因素，但是其共享的易感基因卻只是部分重疊，9p21被證實(shí)既跟冠狀動(dòng)脈病變也跟腦大動(dòng)脈病變及顱內(nèi)動(dòng)脈瘤有關(guān)，PITX2、ZFHX3既與房顫也與心源性腦卒中相關(guān)。有較強(qiáng)證據(jù)證實(shí)CYP17A1、RAI1、SH2B3、HDAC9、ABO和9p21是心腦血管事件共享的易感基因［12，13］。這種血管床/組織特異性的易感基因群，難以解釋心腦血管病患者常見有循環(huán)系統(tǒng)的大小血管均受累及，只是某個(gè)血管床的損害更嚴(yán)重的臨床病理現(xiàn)象。因此，進(jìn)一步在模式動(dòng)物上驗(yàn)證上述心腦血管病變共享的易感基因，以確定病理?yè)p害的選擇性和特異性［16，17］。

檢索并歸納已發(fā)表的有關(guān)缺血性腦卒中易感基因的系列研究報(bào)道，可以發(fā)現(xiàn)他們主要涉及以下幾類基因的多態(tài)性研究:腎素－血管緊張素系統(tǒng)基因、動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)和功能障礙相關(guān)基因、炎癥反應(yīng)相關(guān)基因、脂蛋白基因、血小板功能障礙相關(guān)基因、凝血/纖溶系統(tǒng)相關(guān)基因、亞甲基四氫葉酸還原酶基因、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因、心鈉素基因、胰島素受體基因等。這一系列缺血性腦卒中易感基因集合成“易感基因群”［1～3，20，21］。但這些基因的SNPs在不同種族的患者中，并不能重復(fù)驗(yàn)證，說(shuō)明這些SNPs本身的作用是微弱的，需產(chǎn)生累積效應(yīng)而致病;或僅見于某些種族，或僅見于某個(gè)腦卒中亞型［1～7］。

4 缺血性腦卒中易感基因群在不同種族人群的表達(dá)

Meta分析證實(shí)了缺血性腦卒中易感基因群在不同的種族和人群既存在相似性也存在差異性［20，21］，即:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因(ACE)D/I，亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)C677T，β-纖維蛋白原基因(β-Fg)-455A/G，β-Fg-148T/C，纖溶酶原激活物抑制物-1基因(PAI-1)4G/5G和載脂蛋白E基因(ApoEε2-4)是中國(guó)漢族人易感基因群;而凝血因子V Leiden突變(factor V Leiden)，亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)，凝血酶原基因(prothrombin)和血管緊張素還原酶基因(ACE)是高加索人的缺血性腦卒中易感基因群。磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)基因與亞洲人缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性，其中SNP83是一個(gè)重要的生物學(xué)標(biāo)志［21］。但歐美白種人的缺血性腦卒中與PDE4D基因不存在顯著相關(guān)性。

從2002年開始，缺血性腦卒中的基因型－表型的關(guān)聯(lián)研究進(jìn)入GWAS時(shí)代，這得益于人類基因組和人類基因組單體型圖計(jì)劃(human genome and hapMap projects)的完成以及超級(jí)通量基因型芯片技術(shù)的發(fā)展和應(yīng) 用 (ultra-high-volume genotyping chip technologies)［22～26］。盡管如此，在初期階段，對(duì)缺血性腦卒中這個(gè)大臨床表型進(jìn)行的研究中仍然有較多的矛盾結(jié)果。對(duì)部分缺血性腦卒中亞型的研究結(jié)果亦不可重復(fù)。為解決這些問題，后續(xù)進(jìn)行了薈萃分析GWAS，成立國(guó)際性的腦卒中協(xié)作組織以增加樣本量，并對(duì)納入的缺血性腦卒中患者進(jìn)行更精準(zhǔn)的病因分型，改進(jìn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，使研究結(jié)果更可靠并提升了結(jié)果的可重復(fù)。

2012年，WTCCC2(the joint international stroke genetics consortium/wellcome trust case control consortium 2)的研究證實(shí)［27］，HDAC9與缺血性腦卒中相關(guān)，并且證實(shí)PITX2、ZFHX3與心源性腦卒中相關(guān)，9p21基因座位與大血管病變性缺血性腦卒中相關(guān)。澳大利亞腦卒中遺傳學(xué)協(xié)作組發(fā)現(xiàn)，6p21.1與大血管病變性缺血性腦卒中相關(guān)［28］，該位點(diǎn)在中國(guó)新疆維吾爾族［29］和中國(guó)漢族女性的大血管病變性缺血性腦卒中獲得證實(shí)。進(jìn)一步對(duì)已發(fā)表的GWAS研究的薈萃分析(METASTROKE)再次證實(shí)，PITX2、ZFHX3與心源性腦卒中相關(guān)，9p21基因座位、HDAC9與大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性腦卒中相關(guān)［30］。

2016年，由美國(guó)國(guó)立神經(jīng)疾病與中風(fēng)研究院牽頭并主導(dǎo)的腦卒中遺傳學(xué)研究網(wǎng)絡(luò)(NINDS Stroke Genetics Network，SiGN)和國(guó)際腦卒中遺傳學(xué)研究聯(lián)合體(International Stroke Genetics Consortium，ISGC)，在 Lancet Neurol發(fā)表了迄今為止最大、最全面的腦卒中亞型的GWAS研究［11］。這項(xiàng)大型研究，除了重復(fù)證實(shí)了僅有4個(gè)與缺血性腦卒中相關(guān)的基因座位(PITX2、ZFHX3與心源性腦卒中相關(guān);而HDAC9與大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中相關(guān);在ALDH2基因附近的12q24基因座位與所有缺血性腦卒中相關(guān))外，還發(fā)現(xiàn)一個(gè)與大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中相關(guān)的新基因，位于TSPAN2基因附近的1p13.2座位。但是，該研究的不足也是顯著的，首先，入組的患者中歐洲血統(tǒng)的患者占的比重較大，導(dǎo)致了較大的偏倚。其次，基于TOAST的腦卒中病因分型，在研究的第二階段，混入了表型雜合性(phenotypic heterogeneity)，削弱了研究的說(shuō)服力。第三，新發(fā)現(xiàn)的TSPAN2基因在其他種族未能重復(fù)。第四，SiGN的研究資料中，沒有或罕有能夠獲得缺血性腦卒中特異性的危險(xiǎn)因素，而這些因素對(duì)解開基因與環(huán)境的互作又十分重要。該文作者指出今后的研究仍然要面臨的挑戰(zhàn)，一方面，在該項(xiàng)研究中，有12.6%～22.3%的缺血性腦卒中患者使用TOAST和CCS(causative classification of stroke，CCS)［10］兩種分型方法，分型為未能確定病因的缺血性腦卒中，說(shuō)明繼續(xù)精準(zhǔn)區(qū)分疾病的表型面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn);另一方面，重視環(huán)境因素作為病因性因素(causative factors)在疾病發(fā)生過(guò)程中的作用等。

綜上 GWAS的研究進(jìn)展，我們可以發(fā)現(xiàn)，目前GWAS主要檢測(cè)人群中頻率相對(duì)較高(＞5%)的SNPs，無(wú)法涵蓋復(fù)雜疾病所有的基因變異，人類基因組中還有許多與疾病相關(guān)的低頻SNPs，或罕見變異有可能被遺漏。GWAS只對(duì)統(tǒng)計(jì)上與疾病最顯著相關(guān)的基因位點(diǎn)進(jìn)行研究，如果單位點(diǎn)遺傳效應(yīng)微弱而相互作用較強(qiáng)時(shí)，GWAS就可能因忽略了基因－基因相互影響而低估基因網(wǎng)絡(luò)的作用;GWAS未能對(duì)基因－環(huán)境相互影響進(jìn)行很好的分析，有可能忽略環(huán)境因素的影響，從而高估了遺傳因素在發(fā)病機(jī)制中的作用［31］。

新近的全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，2個(gè)新基因的罕見變異增加了缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。一個(gè)為 PDE4DIP (rs1778155)編碼區(qū)的變異，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，但是，在外顯子組芯片分析(exome chip analyses)中未能重復(fù)證實(shí);另外一個(gè)為ACOT4(rs35724886)編碼區(qū)的變異，參與脂肪酸代謝，但是，未能在其他隊(duì)列中重復(fù)驗(yàn)證。但是，該研究卻重復(fù)驗(yàn)證了2個(gè)GWAS驗(yàn)證的基因，分別是與心源性腦卒中相關(guān)的ZFHX3、與大血管病變性缺血性腦卒中相關(guān)的ABCA1。說(shuō)明遺傳變異通過(guò)不同的途徑(pathways)參與了腦卒中的發(fā)病過(guò)程［14］。

5 與亞裔人群缺血性腦卒中密切相關(guān)的易感基因

我們需要特別重視兩項(xiàng)跟亞裔人群缺血性腦卒中密切相關(guān)的易感基因的研究新進(jìn)展。2007年，日本人的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)［15］，PRKCH(rs2230500)1425G/A SNP與腔隙性腦梗死相關(guān)。該研究的另外一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，在一個(gè)隊(duì)列進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)14年的隨訪，發(fā)現(xiàn)該基因參與了腔隙性腦梗死的發(fā)生，并且，病理發(fā)現(xiàn)該基因主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣損害的泡沫細(xì)胞(foamy macrophages)中表達(dá)。中國(guó)人的研究資料顯示，PRKCH1425G/A SNP增加缺血性腦卒中和腦出血的風(fēng)險(xiǎn)。薈萃分析發(fā)現(xiàn)［32］，PRKCH 1425G/A SNP既是日本人的，也是中國(guó)人的缺血性腦卒中，尤其是腔隙性腦梗死的易感基因。

在經(jīng)歷了病例對(duì)照研究的矛盾結(jié)果(跟樣本量小及腦卒中表型變異大有關(guān))、薈萃分析得到的有沖突的結(jié)果后(一項(xiàng)薈萃研究提示與缺血性心臟病和缺血性腦卒中相關(guān)，而另外一項(xiàng)薈萃研究卻提示不相關(guān))，2016年，Loes等［22］證實(shí)，MTHFR C677T是經(jīng)MRI證實(shí)的腔隙性腦梗死和腦白質(zhì)高密度亞型有關(guān)，這兩者均限定為腦小動(dòng)脈病變導(dǎo)致，而不是大動(dòng)脈和心源性腦卒中的易感基因位點(diǎn)，但是尚需得到其他隊(duì)列重復(fù)驗(yàn)證后進(jìn)一步的證實(shí)。一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)人群的H型高血壓的臨床干預(yù)試驗(yàn)(the china stroke primary prevention trial，CSPPT)［33］，表明降低同型半胱氨酸對(duì)腦卒中的一級(jí)預(yù)防是有效的。由于高血壓主要影響小動(dòng)脈病變，CSPPT研究結(jié)論提示在缺血性腦卒中亞型—腦小動(dòng)脈病變中同型半胱氨酸的編碼基因MTHFR的潛在作用。

綜上所述，不論是候選基因研究法，或是GWAS和外顯子組測(cè)序法所得到的海量缺血性腦卒中的遺傳信息，我們讀懂了部分缺血性腦卒中亞型的易感基因［11］，又在曾被否定的缺血性腦卒中易感基因中有新的發(fā)現(xiàn)［14，22］。而大多數(shù)我們尚未讀懂的缺血性腦卒中亞型的遺傳信息亟待我們進(jìn)一步的深入研究。某一易感基因的結(jié)構(gòu)和功能如何?成簇的易感基因群如何形成基因網(wǎng)絡(luò)而相互作用以及與敏感環(huán)境因素如何相互作用?易感基因群是如何動(dòng)態(tài)影響血管表型及血管病理變化的?缺血性腦卒中大、小血管病變亞型有共同的易感基因嗎［34］?針對(duì)這些問題，利用高效特異的基因編輯/修飾工具CRISPR/Cas9［35，36］或TALEN［19］修飾(敲入或敲除)靶基因，在模擬建模人類多基因復(fù)雜疾病—缺血性腦卒中亞型斑馬魚模型的基礎(chǔ)上，在模式生物斑馬魚動(dòng)態(tài)觀察血管表型和血管病理等方面［16，17］，將有新發(fā)現(xiàn)，獲得新視點(diǎn)［5，7，36，37］。

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10.11864/j.issn.1673.2017.01.01

2016-11-05

2016-12-31)