吳新濤 石晶 高樂才 吳文元 龐石磊

·論著·

柚皮素對破骨細胞特異性基因及OPG/RANKL/RANK表達的影響

吳新濤 石晶 高樂才 吳文元 龐石磊

目的 觀察柚皮素對破骨細胞特異性基因組織蛋白酶-K(CATK)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及骨保護素/核因子-κB 受體活化因子配體/核因子-κB 受體活化因子(OPG/RANKL/RANK)表達的影響。方法 采用全骨髓細胞誘導法培養(yǎng)破骨細胞，細胞分5組：空白對照組、HG-DMEM誘導組、HG-DMEM+0.1 μmol/L柚皮素組、HG-DMEM+1 μmol/L柚皮素組、HG-DMEM+10 μmol/L柚皮素組。HE染色、TRAP染色觀察破骨細胞形態(tài)；分光光度計檢測TRAP陽性細胞數(shù)；Real time-PCR和Western-blot檢測CATK、MMP-9、TRAP及OPG/RANKL/RANK mRNA和蛋白表達。結(jié)果 與空白對照組比較，HG-DMEM誘導組TRAP陽性細胞數(shù)、TRAP、MMP-9、CATK、RANKL、RANK mRNA和蛋白表達明顯增加，OPG mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)。 與HG-DMEM誘導組比較，柚皮素預處理24h能夠明顯降低TRAP陽性細胞數(shù)、CATK、MMP-9、TRAP、RANKL、RANKmRNA和蛋白表達，增加OPGmRNA和蛋白表達(P<0.05)，呈劑量依賴性。結(jié)論 柚皮素能夠抑制破骨細胞的生成和分化，該作用可能是通過OPG/RANKL/RANK信號通路抑制TRAP、MMP-9、CATK表達實現(xiàn)的。

柚皮素；破骨細胞；OPG/RANKL/RANK信號通路

近年來，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐漸升高，已經(jīng)成為影響人們生活質(zhì)量的主要疾病之一[1]。其病理機制是成骨細胞介導的骨生成和破骨細胞介導的骨吸收過程失衡，導致骨吸收速率超過骨生成，最終引起骨量丟失。破骨細胞是唯一具有骨吸收作用的細胞，其來源于骨髓造血干細胞，在RANKL、M-CSF誘導下形成，對于維持骨量至關(guān)重要[2]。中草藥柚皮苷屬黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、保護神經(jīng)、治療骨質(zhì)疏松癥等藥理作用。柚皮素是柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物，體外實驗表明柚皮素對大鼠成骨細胞促骨形成活性優(yōu)于柚皮苷[3,4]。然而，柚皮素是否影響破骨細胞的分化、成熟目前尚不清楚。本研究利用體外培養(yǎng)的破骨細胞，通過觀察柚皮素對破骨細胞特異性基因CATK、MMP-9、TRAP及OPG/RANKL/RANK表達的影響，旨在闡明柚皮素防治骨質(zhì)疏松癥的具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖-DMEM(HG-DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；兔抗鼠CATK、MMP-9、TRAP、OPG、RANKL、RANK、β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；細胞裂解液、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；Prime Script TM RT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Trizol、實時熒光定量試劑盒購自美國Promega公司?？筎RAP檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.2 動物 雌性SD大鼠，胸自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物合格證號：SCXK-(京)2012-0001]體重180～215 g，清潔級，恒溫、恒濕條件下飼養(yǎng)。

1.3 儀器 Chemi DocTM XRS+化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Biorad公司)；7300 型Real time-PCR擴增儀(美國ABI公司)；倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司)。

1.4 破骨細胞誘導培養(yǎng) 參照相關(guān)文獻報道采用全骨髓細胞誘導培養(yǎng)法培養(yǎng)破骨細胞[5]。大鼠無水乙醚處死后，75%乙醇浸泡10 min，無菌手術(shù)切取雙側(cè)股骨，去除表面附著的肌肉和筋膜，75%乙醇浸泡1 min，于超凈工作臺上剪掉兩端干骺端，充分暴露骨髓腔，PBS反復沖洗。骨髓細胞1 000 r/min離心5 min，棄上清，接種于培養(yǎng)瓶中，加入HG-DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，青、鏈霉素各100 U/ml)，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)30 min。收集細胞懸液，接種于6孔板中，加入含40 ng/ml RANKL和40 ng/ml M-CSF的HG-DMEM培養(yǎng)基液誘導培養(yǎng)7 d，調(diào)整細胞密度為1×107/ml，每3天換液1次。待細胞生長至80%融合時根據(jù)需要進行相關(guān)指標的檢測。

1.5 分組及給藥 細胞分5組：空白對照組(只加HG-DMEM培養(yǎng)基)；HG-DMEM誘導組(加入含RANKL、M-CSF各40 ng/ml的HG-DMEM誘導液)；HG-DMEM+柚皮素組，在HG-DMEM誘導液存在的情況下，分別加入0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L柚皮素。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 HE染色觀察破骨細胞形態(tài):細胞消化后接種于24孔板中，調(diào)整細胞密度為1×107/ml，進行HE染色，在(×200)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.6.2 破骨細胞計數(shù):細胞接種于24孔板中，進行TRAP染色，鏡下可見胞漿中紅色顆粒樣沉淀，即為TRAP陽性染色，細胞核呈陰性，計數(shù)有3個及3個以上細胞核的細胞為破骨細胞。每孔隨機選取3個視野(×200)，計算均值。

1.6.3 分光光度計檢測TRAP活性:收集細胞上清液，于530 nm波長處檢測吸光度值，嚴格按照試劑盒說明書計算TRAP活性。

1.6.4 Real time-PCR:Trizol提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進行逆轉(zhuǎn)錄反應，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴增。由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達相對值RQ=2ΔΔCt。見表1。

表1 Real time-PCR引物序列

1.6.5 Western-blot:提取細胞總蛋白，半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，化學發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，β-actin作為內(nèi)參照，以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠破骨細胞的培養(yǎng)和鑒定HE染色結(jié)果顯示，最初采集的骨髓造血干細胞呈大小一致的圓形，懸浮生長。3d后可見單核細胞數(shù)目逐漸增多，細胞突起互相連接，細胞逐漸融合；培養(yǎng)5d時單核細胞融合匯聚現(xiàn)象更明顯，逐漸形成多核的破骨細胞； 7d時多核的破骨細胞數(shù)量達峰值，細胞形態(tài)不規(guī)則，胞體較大，胞核約3～20個，細胞邊緣不整，周邊可有偽足伸出。破骨細胞TRAP染色可見鏡下具有大量空泡和偽足的多核細胞，胞漿呈紫紅色陽性反應，細胞呈圓形，數(shù)量不等，胞體呈煎蛋狀、漏斗狀、索條狀，形態(tài)不規(guī)則。

2.2 柚皮素對破骨細胞形成數(shù)量、TRAP活性的影響 與空白對照組比較，HG-DMEM誘導組破骨細胞數(shù)量、TRAP活性明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低破骨細胞數(shù)量、TRAP活性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表2。

組別TRAP陽性細胞數(shù)TRAP活性(U/L)空白對照組67.23±6.142.78±0.35HG-DMEM誘導組206.35±13.67*10.14±1.56*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組166.21±10.64*#8.42±1.12*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組132.53±10.42*△6.20±0.88*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組91.56±7.44*☆4.01±0.57*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

2.3 柚皮素對破骨細胞TRAP、MMP-9、CATK表達的影響 與空白對照組比較，HG-DMEM誘導組破骨細胞TRAP、MMP-9、CATKmRNA和蛋白表達水平明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低RANKL促進破骨細胞特異性基因TRAP、MMP-9、CATKmRNA和蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表3、4。

組別CATKmRNAMMP-9mRNATRAPmRNA空白對照組0.56±0.080.37±0.060.42±0.05HG-DMEM誘導組1.89±0.27*1.77±0.24*1.80±0.23*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組1.50±0.22*#1.40±0.21*#1.46±0.23*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組1.23±0.18*△1.13±0.15*△1.18±0.16*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組0.89±0.11*☆0.69±0.10*☆0.70±0.11*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

組別CATK蛋白MMP-9蛋白TRAP蛋白空白對照組0.43±0.060.28±0.040.36±0.04HG-DMEM誘導組1.70±0.24*1.64±0.22*1.68±0.21*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組1.42±0.21*#1.30±0.17*#1.35±0.20*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組1.08±0.16*△1.01±0.14*△1.04±0.13*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組0.69±0.10*☆0.56±0.07*☆0.60±0.08*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

2.4 柚皮素對破骨細胞OPG、RANKL、RANK表達的影響 與空白對照組比較，HG-DMEM誘導組破骨細胞OPGmRNA和蛋白表達水平明顯降低，RANKL、RANKmRNA和蛋白表達水平明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯增加OPGmRNA和蛋白表達水平，降低RANKL、RANKmRNA和蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表5、6。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是由于遺傳、環(huán)境、雌激素缺乏等因素導致成骨細胞合成新骨不足或破骨細胞吸收舊骨過多的骨平衡過程失衡，最終導致骨骼完整性破壞、骨量減少、骨密度降低[6]。而破骨細胞生成是骨重建過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，OPG/RANKL/RANK是成骨細胞/骨髓間質(zhì)細胞與破骨細胞之間的橋梁，在破骨細胞分化、成熟和骨重建過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其具體機制為成骨細胞分泌的RANKL與破骨細胞表面的RANK結(jié)合能夠誘導破骨細胞分化、成熟，并抑制破骨細胞凋亡，進而導致破骨細胞活性增強和骨吸收過程。而成骨細胞和骨髓基質(zhì)干細胞分泌的OPG能夠競爭性拮抗RANKL與RANK結(jié)合，阻斷RANKL/RANK信號轉(zhuǎn)導，從而導致破骨細胞分化、成熟障礙。此外，OPG還能阻斷破骨細胞與基質(zhì)細胞間的相互作用促使破骨細胞凋亡[8,9]。OPG/RANKL比值升高是破骨細胞分化、成熟的重要指標，也是骨吸收和骨形成保持平衡狀態(tài)的關(guān)鍵。TRAP、MMP-9、CATK是成熟破骨細胞特異性表達的基因[10]。TRAP是成熟破骨細胞和融合前單核細胞表達的一種含鐵糖蛋白，其結(jié)構(gòu)高度保守，能夠水解無機磷酸鹽類和磷酸醋酶，并破壞胞轉(zhuǎn)時內(nèi)吞噬的基質(zhì)退化物。MMP-9能夠降低細胞外基質(zhì)成分，參與破骨細胞向骨表面遷移及骨吸收過程。CATK是破骨細胞分泌的一種半甘氨酸蛋白酶，具有很強的溶骨活性，在骨吸收過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

組別OPGmRNARANKLmRNARANKmRNA空白對照組1.37±0.220.56±0.080.49±0.06HG-DMEM誘導組0.40±0.06*1.99±0.23*1.78±0.22*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組0.59±0.08*#1.67±0.20*#1.37±0.21*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組0.85±0.12*△1.20±0.18*△1.00±0.15*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組1.09±0.15*☆0.93±0.12*☆0.68±0.10*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

組別OPG蛋白RANKL蛋白RANK蛋白空白對照組1.29±0.200.47±0.060.38±0.05HG-DMEM誘導組0.30±0.05*1.81±0.20*1.67±0.21*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組0.48±0.05*#1.56±0.18*#1.20±0.18*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組0.71±0.10*△1.09±0.14*△0.89±0.11*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組0.93±0.12*☆0.79±0.11*☆0.57±0.07*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

根據(jù)中醫(yī)腎主骨理論，中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥應以補腎藥物為主。孫闖等[11,12]研究表明，淫羊藿苷能夠明顯上調(diào)小鼠骨溶解模型OPGmRNA和蛋白表達，下調(diào)RANKLmRNA和蛋白表達，使OPG/RANKL比值升高從而抑制骨吸收。萬雷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，骨康含藥血清能夠提高成骨細胞和破骨細胞共育體系中OPG/RANKL比值，抑制過度的骨吸收。中草藥骨碎補具有補腎強骨的功效，藥效學研究表明骨碎補的主要成分柚皮苷對骨質(zhì)疏松癥有一定治療作用。柚皮素是柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物，體外實驗表明柚皮素對大鼠成骨細胞促骨形成活性要優(yōu)于柚皮苷[3,4]。本研究通過觀察柚皮素對破骨細胞特異性基因TRAP、MMP-9、CATK及OPG/RANKL/RANK表達的影響，旨在探討柚皮素治療骨質(zhì)疏松癥的具體分子機制。結(jié)果顯示，柚皮素在HG-DMEM誘導狀態(tài)下能夠明顯降低TRAP陽性細胞數(shù)、TRAP、MMP-9、CATK、RANKL、RANKmRNA和蛋白，增加OPGmRNA和蛋白表達(P<0.05)，呈劑量依賴性，提示柚皮素能夠明顯抑制破骨細胞分化、成熟，促使骨組織向成骨方向發(fā)展。

綜上所述，柚皮素對HG-DMEM誘導的破骨細胞分化、成熟具有拮抗作用，其機制與上調(diào)OPG、下調(diào)RANKL、RANK表達有關(guān)。本研究闡明了柚皮素抑制破骨細胞分化、成熟的可能機制，這不僅有助于認識骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制，還揭示了中藥柚皮素治療骨質(zhì)疏松癥的分子機制。以OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)為靶點可能為骨質(zhì)疏松癥的臨床治療提供了新方向。

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Effects of naringenin on the expressions of osteoclast specific genes and OPG/RANKL/RANK in osteoclasts

WUXintao,SHIJing,GAOLecai,etal.

DepartmentofOsteology,IntegratedTCMandWesternMedicineHospitalofCangzhouCity,Hebei,Cangzhou061001,China

Objective To observe the effects of naringenin on the expressions osteoclast specific genes-CATK,MMP-9,TRAP and OPG/RANKL/RANK in osteoclasts.Methods The osteoclasts were cultured by whole bone marrow cells induction method.The experiment was divided into 5 groups:blank control group,HG-DMEM induction group,HG-DMEM+naringenin (0.1μmol/L) group,HG-DMEM+naringenin (1μmol/L) group and HG-DMEM+naringenin (10μmol/L) group. After HE and TRAP stainings, the cell morphous was observed under inverted microscope. The TRAP positive cell number was detected by spectrophotometer. The expression levels of CATK, MMP-9,TRAP as well as OPG/RANKL/RANK mRNA and protein were detected by Real time-PCR and Western Blot.Results As compared with those in blank control group, the TRAP positive cell number and the expression levels of TRAP,MMP-9,CATK,RANKL,RANK mRNA and protein were significantly increased in HG-DMEM induction group,however, the expression levels of OPG mRNA and protein were significantly decreased (P<0.05).AscomparedwithHG-DMEMinductiongroup,after24-hourpretreatment,naringenincouldobviouslydecreaseTRAPpositivecellnumberandtheexpressionlevelsofCATK,MMP-9,TRAP,RANKL,RANKmRNAandprotein,andcouldincreasetheexpressionlevelsofOPGmRNAandprotein,withadose-dependentway(P<0.05).Conclusion Naringenin can inhibit the generation and differentiation of osteoclasts,and the action may be realized by regulating OPG/RANKL/RANK signal transduction pathway to inhibit the expressions of TRAP, MMP-9,CATK.

naringenin; osteoclast; OPG/RANKL/RANK signal transduction pathway

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.02.001

項目來源：河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(編號:2016267)

061001 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科

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A

1002-7386(2017)02-0165-04

2015-11-11)