林黛琴，王婷婷，萬(wàn)承波，邱 萍

(1.江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)院，江西 南昌 330029；2.南昌大學(xué)化學(xué)系，江西 南昌 330031)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定食品中5種罌粟殼生物堿

林黛琴1，王婷婷1，萬(wàn)承波1，邱 萍2

(1.江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)院，江西 南昌 330029；2.南昌大學(xué)化學(xué)系，江西 南昌 330031)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)定性定量分析食品中非法添加的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁等5種罌粟殼生物堿。采用Capcell PAK C18 TYPE MGⅡ(5 μm×2.0 mm×150 mm)色譜柱分離，以10 mmol/L乙酸銨(pH 4.2)-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，得到了較寬的線性范圍和較低的定量檢出限。嗎啡和可待因的線性范圍為1.0～20.0 μg/L，蒂巴因、罌粟堿和那可丁的線性范圍為0.2～4.0 μg/L，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。食品中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁的定量限分別為7.5、7.5、1.5、1.5、1.5 μg/kg。方法的回收率和重現(xiàn)性較好，5種罌粟殼生物堿的回收率在72.2%～111.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.1%～8.8%之間。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，可用于食品中5種非法添加罌粟殼生物堿的定量及確證分析。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)；罌粟殼；嗎啡；可待因；蒂巴因；罌粟堿；那可丁

罌粟殼是罌粟科植物罌粟采完鴉片后的干燥成熟果殼，含有20多種生物堿，其中嗎啡(morphine)、可待因(codeine)、罌粟堿(papavarine)、蒂巴因(tibane)、那可丁(narcotine)等為其主要成分[1]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1。這5種物質(zhì)均為異喹啉型生物堿，具有一定的藥用價(jià)值[2]，但其副作用也不可低估。如食用后會(huì)使人嗜睡、性格改變，可引起某種程度的愜意和欣快感，造成人的注意力、思維和記憶性能衰退，

長(zhǎng)期食用還會(huì)引起精神失常、出現(xiàn)幻覺(jué)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致呼吸停止而死亡[3]。衛(wèi)生部印發(fā)的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》中明確規(guī)定，食品中的罌粟殼屬于違法添加物質(zhì)。由于添加了罌粟殼的食物味道鮮美，易使消費(fèi)者成癮，長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)其產(chǎn)生依賴性，因此一些不法商家在火鍋、麻辣燙、烤禽類等湯料或輔料中添加罌粟殼及其水浸物等違禁原料，以吸引更多的食客。對(duì)此種行為國(guó)家已多次明令禁止，也要求有關(guān)部門嚴(yán)厲查處。因此，建立罌粟殼生物堿的簡(jiǎn)便、快速、高效的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

圖1 罌粟殼中5種生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of five opium poppy husk alkaloids

目前，測(cè)定罌粟殼中生物堿的方法主要有層析法[4]、示波極譜法[5]、分光光度法[6]、高效液相色譜法[7-13]、氣相色譜法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜法[15-16]和液相色譜-質(zhì)譜法[17-20]。其中，層析法、示波極譜法、分光光度法的干擾物質(zhì)較多，只可對(duì)單一成分做定性和半定量測(cè)定；液相色譜法和氣相色譜法不能對(duì)目標(biāo)化合物準(zhǔn)確定性，會(huì)產(chǎn)生一些假陽(yáng)性結(jié)果；液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定多組分罌粟殼生物堿主要是通過(guò)結(jié)合固相萃取小柱來(lái)完成的，該方法的前處理復(fù)雜，不適合快速檢測(cè)，且運(yùn)行成本較高。

本研究擬用5%氨化甲醇作為目標(biāo)化合物提取劑，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)通過(guò)優(yōu)化前處理、色譜和質(zhì)譜條件，建立可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中 5 種罌粟殼生物堿(嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可丁)的方法，旨為開展此類違禁添加物的監(jiān)測(cè)和食品安全管理提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 6410A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有Agilent 1200高效液相色譜儀及電噴霧離子源；Milli-Q超純水器：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；IKA T25均質(zhì)器：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；SI Vortex Genie 2漩渦混合器：美國(guó)Scientific Industries公司產(chǎn)品；KQ-600DE型數(shù)控超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Sigma 3-18K低溫離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；Eyela MMV-1000W振蕩器：日本Eyela公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

罌粟殼中生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(嗎啡、可待因濃度為50 mg/L、罌粟堿濃度為10 mg/L)：美國(guó)O2si smart solutions公司產(chǎn)品；乙酸銨、氨水(色譜純)：美國(guó)ACS恩科化學(xué)有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇(色譜純)：美國(guó)Honeywell有限公司產(chǎn)品；甲酸(色譜純)：美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；正己烷(色譜純)：天津康科德科技有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中，嗎啡和可待因的系列濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L；蒂巴因、罌粟堿和那可丁的系列濃度為0.2、0.4、1.0、 2.0、4.0 μg/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：資生堂Capcell PAK C18 TYPE MGⅡ(5 μm×2.0 mm×150 mm)；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.01 mol/L乙酸銨溶液(pH 4.2)；梯度洗脫程序：0～1.0 min、10%A，1.0～5.0 min、10%～55%A，5.0～5.5 min、55%A，5.5～6.0 min、55%～10%A，6.0～15.0 min、10%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件 霧化氣壓力3.1×105Pa，毛細(xì)管電壓4 000 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速8 L/min。嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、保留時(shí)間、解離電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 5種罌粟殼生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of five opium poppy husk alkaloids

注：*為定量離子

1.4 樣品前處理

稱取2 g(精確至0.01 g)均勻樣品于50 mL離心管中，加入7.5 mL 5%氨化甲醇，渦旋1 min后，振蕩5 min，超聲提取30 min，于4 ℃以15 000 r/min離心10 min；移取有機(jī)相層至另一離心管中，用7.5 mL 5%氨化甲醇再次提取殘?jiān)?，合并有機(jī)相；然后用甲醇飽和的正己烷去除有機(jī)相中油脂，然后除去正己烷層，用5%氨化甲醇定容至15 mL，取適量過(guò)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜，待LC-MS/MS測(cè)定。

基質(zhì)空白外標(biāo)曲線溶液的配制：稱取2 g(精確至0.01 g)空白基質(zhì)樣品，按上述步驟處理，得到的基質(zhì)提取液用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及高含量樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 考察了資生堂 MGⅡ C18柱(5 μm×2.0 mm×150 mm)、ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(3.5 μm×2.1 mm×150 mm)和Aglient XBridgeTMC18柱(3.5 μm×2.1 mm×100 mm)3種不同的高效液相色譜柱對(duì)各組分的分離效果。結(jié)果表明：資生堂MGⅡC18柱的分離效果最好，且峰形更佳；Aglient XBridgeTMC18柱的分離效果較差，無(wú)法分離蒂巴因和罌粟堿。因此，選擇資生堂MGⅡ C18柱作為高效液相色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 考察了0.1%甲酸水-乙腈、乙酸銨(pH 3.5)-乙腈、乙酸銨(pH 4.2)-乙腈、乙酸銨(pH 5.5)-乙腈4種溶液作為流動(dòng)相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的峰型變寬，組分之間的分離嚴(yán)重，且嗎啡在色譜柱中無(wú)保留；不同pH值乙酸銨體系作為流動(dòng)相時(shí)，隨著pH值的增大，三組分的分離度增大，保留時(shí)間增長(zhǎng)，但嗎啡的響應(yīng)在pH 3.5及pH 5.5時(shí)均減小，而在pH 4.2時(shí)能使各組分得到較好的分離，且響應(yīng)值最高。因此，選擇乙酸銨(pH 4.2)-乙腈溶液作為流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

罌粟殼中的生物堿易溶于甲醇等有機(jī)溶劑，常用于提取罌粟殼中生物堿的溶劑有鹽酸溶液[18]、酸化乙腈水溶液[19]、乙醇水溶液[12]、甲醇溶液[9]等。本研究在分析火鍋底料、調(diào)味油、辣椒醬和固態(tài)復(fù)合調(diào)味料4種不同類型的樣品時(shí)，分別考察了鹽酸溶液、鹽酸-乙腈(1∶1，V/V)溶液、乙腈水溶液、5%氨化甲醇的提取效果。結(jié)果表明：酸性條件下所得的提取物在色譜柱上的分離效果較差，提取率不足50%；乙腈水溶液提取液中的可待因峰形較差；氨化甲醇提取液中的生物堿能在色譜柱上得到較好的分離，提取率為72%～111%；采用鹽酸-乙腈提取液過(guò)MCX柱進(jìn)行凈化，氨化甲醇定容，提取的生物堿類成分能得到較好的分離，但步驟繁瑣。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇氨化甲醇作為提取溶劑。

2.3 質(zhì)譜的定性定量分析

根據(jù)5種生物堿的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇電噴霧正離子(ESI+)電離模式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行Q1全掃描。分別準(zhǔn)確找出各分子離子峰，然后對(duì)其子離子進(jìn)行Q3全掃描，將2～3個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的碎片離子與母離子組成監(jiān)測(cè)離子對(duì)，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。5種生物堿的定量離子分別為m/z181.1(嗎啡)、m/z165(可待因)、m/z58.1(蒂巴因)、m/z171.1(罌粟堿)、m/z220.2(那可丁)，其離子掃描圖和解離圖示于圖2。

從圖1可見，嗎啡和可待因的分子結(jié)構(gòu)式非常相似，二者的差異僅在與苯環(huán)相連的1個(gè)基團(tuán)(羥基、甲氧基)，相對(duì)分子質(zhì)量分別為285.1、299.1。對(duì)分子離子m/z286.1[M+H]+、m/z300.1[M+H]+進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，它們的空間分子結(jié)構(gòu)在誘導(dǎo)能量碰撞下不穩(wěn)定，產(chǎn)生多種斷鍵方式，形成豐富的碎片離子峰，示于圖2a和2b。從碎片離子組成可以看出，二者的裂解規(guī)律相似；蒂巴因m/z311.4在電噴霧正離子(ESI+)電離模式掃描下加氫得到分子離子m/z312.2 [M+H]+，進(jìn)一步進(jìn)行MS2掃描，使其斷開化學(xué)鍵，得到特征碎片離子m/z58.1[C3H8N]+和m/z251.1[C16H11O3]+，斷鍵位點(diǎn)示于圖2c；罌粟堿m/z339在ESI+下加氫得到分子離子m/z340.1[M+H]+，然后斷鍵，先脫去鄰二甲氧基苯m/z138[C6H4(OCH3)2]，得到特征碎片離子m/z202.1 [M+H—C6H4(OCH3)2]+，部分特征碎片離子m/z202.1[M+H—C6H4(OCH3)2]+在誘導(dǎo)能量碰撞時(shí)進(jìn)一步脫去2個(gè)甲基，得到m/z170.1[M+H—C6H4(OCH3)2—(CH3)2]+，

圖2 嗎啡(a)、可待因(b)、蒂巴因(c)、罌粟堿(d)及那可丁(e)的離子掃描圖和解離圖Fig.2 Product ion scans spectra and proposed fragmentation scheme of morphine (a), codeine (b), tibane (c) , papaverine (d) and narcotinum (e)

這是其另一特征碎片離子，斷鍵位點(diǎn)示于圖2d；那可丁氯化物m/z449[M]在質(zhì)譜條件掃描下，脫氯加氫得到分子離子m/z414.2[M—Cl+H]+，在MS2掃描中脫去苯環(huán)上2個(gè)相鄰的甲氧基得到特征碎片離子m/z353.2[M—Cl+H—(OCH3)2]+，部分特征碎片離子在誘導(dǎo)能量碰撞下進(jìn)一步脫去異苯并呋喃酮，得到另一特征碎片離子m/z220.2[M—Cl+H—(OCH3)2—C8H5O2]+，斷鍵位點(diǎn)示于圖2e。

2.4 工作曲線與定量檢出限

由于樣品中待測(cè)組分痕量、樣品基質(zhì)復(fù)雜、提取凈化步驟繁瑣，在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定時(shí)，為了考察基質(zhì)離子抑制對(duì)定量結(jié)果的影響，在嗎啡和可待因7.5、37.5、75.0 μg/kg 3個(gè)添加水平，以及蒂巴因、罌粟堿和那可丁1.5、7.5、15 μg/kg 3個(gè)添加水平下，分別使用空白樣品提取液配制工作溶液，氨化甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)其進(jìn)行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者的回收率差異較大，不同樣品的基質(zhì)效應(yīng)不同，離子化效率在30%～55%之間。由于存在較大的基質(zhì)減弱效應(yīng)，影響了回收率，所以必須考慮扣除基質(zhì)干擾，以提高定量的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)以5種生物堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，選擇基質(zhì)空白加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制工作曲線，外標(biāo)法定量，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。其中，嗎啡、可待因的質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L，蒂巴因、罌粟堿和那可丁的質(zhì)量濃度為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/L。以信噪比S/N=3時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)化合物含量為方法的檢出限，以信噪比S/N=10時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)化合物含量為方法的定量限，結(jié)果列于表2。5種罌粟殼生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及火鍋底料基質(zhì)和樣品的MRM圖示于圖3。

表2 5種罌粟殼生物堿的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of five opium poppy husk alkaloids

2.5 回收率、精密度及實(shí)際樣品檢測(cè)

向沒(méi)有非法添加的火鍋底料、調(diào)味油、辣椒醬和固態(tài)復(fù)合調(diào)味料4種空白樣品中分別添加3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，以基質(zhì)空白工作曲線進(jìn)行定量，計(jì)算方法的回收率及精密度(以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)，結(jié)果列于表3。可見，該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，可以滿足痕量分析要求。

應(yīng)用該方法檢測(cè)了市場(chǎng)的火鍋底料、調(diào)味油、辣椒醬、固態(tài)復(fù)合調(diào)味料各2份樣品，8種樣品均未檢出這5種罌粟殼生物堿，結(jié)果令人滿意。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性定量分析食品中非法添加的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等5種罌粟殼生物堿，其檢出限在0.5～2.5 μg/kg之間，定量限在1.5～7.5 μg/kg之間，平均回收率在 72.2%～111.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 3.1%～8.8%之間，方法的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2大于0.999。該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單，可應(yīng)用于食品中罌粟殼生物堿的檢測(cè)，為食品安全監(jiān)督檢測(cè)提供有力的技術(shù)支持。

圖3 5種罌粟殼生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)、火鍋底料基質(zhì)空白溶液(b)、火鍋底料樣品在檢出限添加水平(c)的MRM譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatograms of a mixed standard solution of five opium poppy husk alkaloids (a), a blank hot pot material sample (b) and the blank hot pot material sample spiked with four yellow dyes (c)

表3 不同食品中5種罌粟殼生物堿的回收率和精密度
Table 3 Recoveries and precisions of the five opium poppy husk alkaloids in different foods

生物堿添加濃度/(μg/kg)火鍋底料調(diào)味油辣椒醬固態(tài)復(fù)合調(diào)味料回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%嗎啡7.590.43.893.56.583.47.977.15.337.578.93.494.18.890.16.6105.98.87579.86.399.93.686.03.798.25.2可待因7.580.43.892.43.974.35.290.75.137.576.83.993.26.173.18.1101.23.97579.44.498.83.483.93.497.23.6蒂巴因1.591.45.293.55.292.94.984.15.97.587.24.4106.84.0111.45.293.24.11588.93.6103.83.294.14.3103.24.2罌粟堿1.582.84.6101.33.596.66.090.54.47.583.93.994.64.485.73.5105.64.01574.54.4102.24.187.73.1104.93.9那可丁1.576.36.7100.96.985.37.772.24.87.574.24.499.93.284.83.977.54.11578.93.7109.24.284.64.176.04.0

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Rapid Determination of Five Opium Poppy Husk Alkaloids in Foods by HPLC-MS/MS

LIN Dai-qin1, WANG Ting-ting1, WAN Cheng-bo1, QIU Ping2

(1.JiangxiInstituteofSupervision&InspectiononProductQuality,Nanchang330029,China;2.DepartmentofChemistry,NanchangUniversity,Nanchang330031,China)

A method of high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was developed for simultaneous determination of the residues of five opium poppy husk alkaloids in foods, such as morphine, codeine, tibane, papaverine and narcotinum. The samples were extracted by methanol (containing 5% ammonia acetate), and then analyzed by HPLC-MS/MS. The separation was carried out by a Capcell PAK C18 TYPE MGⅡ(5 μm×2.0 mm×150 mm) column, with 10 mmol/L ammonium acetate (pH 4.2) and acetonitrile as mobile phases at a flow rate of 0.2 mL/min. Multiple reaction monitoring (MRM) mode was applied, with positive ion electrospray ionization (ESI). Sample matrix-matched calibration was used to determine the residue contents by external standard. Under the optimized detection conditions, the linear ranges for morphine and codeine are 1.0-20.0 μg/L, and for tibane, papaverine and narcotinum are 0.2-4.0 μg/L, the linear correlation coefficients are all more than 0.999. The limits of quantification for morphine, codeine, tibane, papaverine and narcotinum are 7.5, 7.5, 1.5, 1.5 and 1.5 μg/kg, respectively. The recoveries of five opium poppy husk alkaloids range from 72.2% to 111.4% with the relative standard deviations (RSD) of 3.1%-8.8%. This method is simple, effective and sensitive, which is suitable for the determination and confirmation of five opium poppy husk alkaloids added in the foods illegally.

high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS/MS); opium poppy husk; morphine; codeine; tibane; papaverine; narcotine

2016-02-28;

2016-04-11

林黛琴(1979—)，女(漢族)，江西東鄉(xiāng)人，高級(jí)工程師，從事食品檢驗(yàn)分析。E-mail: zzl0711@126.com

時(shí)間：2016-12-22；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20161222.1615.006.html

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0239-09

10.7538/zpxb.youxian.2016.0041