陳紹占，劉麗萍,2，杜宏舉，金鵬飛，周天慧

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069；3.北京醫(yī)院，北京 100730)

高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析經(jīng)牛黃解毒片暴露后大鼠血清中砷形態(tài)

陳紹占1，劉麗萍1,2，杜宏舉1，金鵬飛3，周天慧1

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069；3.北京醫(yī)院，北京 100730)

采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定經(jīng)牛黃解毒片暴露后大鼠血清中的砷形態(tài)。以乙腈為提取劑，采用60 ℃水浴超聲提取法對(duì)血清樣品進(jìn)行前處理，提取液以13 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜。采用Dionex IonPac AS19分析柱(250 mm×4 mm×10 μm)，以20 mmol/L碳酸銨(pH 9.7)-3%甲醇溶液作為流動(dòng)相，分析經(jīng)牛黃解毒片暴露后大鼠血清中的砷形態(tài)。結(jié)果表明，AsB、DMA(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA(Ⅴ)和As(Ⅴ)的檢出限分別為0.05、0.05、0.08、0.10和0.10 μg/L；線性相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.999；加標(biāo)回收率在86.3%～109.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于5%。通過(guò)對(duì)經(jīng)牛黃解毒片暴露后大鼠血清中砷形態(tài)的分析發(fā)現(xiàn)，DMA(Ⅴ)和U1為主要的砷形態(tài)，另外含有少量的AsB和U2。該方法靈敏度高、提取效率好，實(shí)現(xiàn)了多種已知和未知砷形態(tài)的同時(shí)分離，可為研究牛黃解毒片在大鼠血液中的代謝提供技術(shù)支持。

高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)；牛黃解毒片；血清；砷形態(tài)

牛黃解毒片為常用中成藥，具有明顯的解熱、抗炎以及鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用，對(duì)引發(fā)各種炎癥的多種致病微生物有較強(qiáng)的抑制作用。牛黃解毒片由牛黃、黃芩、雄黃、石膏、大黃、桔梗、冰片、甘草等藥材組成[1]，其中雄黃為含砷礦物質(zhì)，主要成分是二硫化二砷，屬不可溶性砷，無(wú)毒性，但其雜質(zhì)中可能含有毒性較大的可溶性三氧化二砷和五氧化二砷。近年來(lái)，牛黃解毒片所致不良反應(yīng)引起了人們的重視。

超量攝入砷或長(zhǎng)期少量攝入砷至體內(nèi)蓄積到一定量均可引起中毒。砷一旦攝入，就會(huì)被人體吸收并分布到全身各處，然后迅速由尿排出。已有研究表明，健康志愿者一次吃3片牛黃解毒片，一日2次，7日后尿中排泄的總砷含量低于攝入劑量的1%[2]。砷的代謝取決于攝入的砷形態(tài)，如三價(jià)砷會(huì)代謝成甲基化的砷形態(tài)，而有一些砷形態(tài)則保持不變。另一項(xiàng)研究表明，攝入單片牛黃解毒片后，人尿中可檢出一甲基砷酸[MMA(Ⅴ)]和二甲基砷酸[DMA(Ⅴ)][3]。常規(guī)臨床監(jiān)測(cè)以測(cè)定尿砷為主，這是由于砷在血液中的清除率非?？?<1 h)[4-5]。尿液中砷形態(tài)的分析方法已有大量研究[6-10]，但可用于全血、血清或血漿中砷形態(tài)分析的方法則較少[11-14]。

在人血中已檢出的砷形態(tài)包括：砷甜菜堿(AsB)、一甲基砷酸[MMA(Ⅴ)]、二甲基砷酸[DMA(Ⅴ)]、三價(jià)砷[As(Ⅲ)]和五價(jià)砷[As(Ⅴ)][12, 15-17]。血液中砷代謝產(chǎn)物的測(cè)定有助于理解補(bǔ)充葉酸在人體內(nèi)對(duì)砷代謝和消除的影響[18]。Pi 等[19]研究了血液中各種砷形態(tài)和氧化應(yīng)激水平之間的關(guān)系，得出氧化應(yīng)激水平和血液中MMA(Ⅴ)與無(wú)機(jī)砷的比例有關(guān)，而不是與砷的濃度有關(guān)。盡管發(fā)表的相關(guān)研究有限，但有報(bào)道認(rèn)為血砷測(cè)定是連續(xù)砷暴露的一個(gè)有用的指標(biāo)[20]。

本工作擬采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析經(jīng)牛黃解毒片暴露后大鼠血清中的砷形態(tài)，通過(guò)優(yōu)化前處理過(guò)程提高提取效率，希望為探究砷化合物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀，7700x型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；Dionex IonPac AS19 陰離子交換柱(250 mm×4 mm×10 μm)及保護(hù)柱：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Milliplus 2150 超純水處理系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；干燥箱：德國(guó)MMM集團(tuán)產(chǎn)品；高速離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；N-EVAP氮吹儀：美國(guó)Organomation公司產(chǎn)品。

超純水：電阻率18.2 MΩ·cm，由Millipore超純水儀制備；(NH4)2CO3、NH3·H2O、NaCl、H2O2(30%)：均為優(yōu)級(jí)純；乙腈、甲醇：北京迪馬科技有限公司產(chǎn)品；硝酸：純度65%，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；亞砷酸根離子As(Ⅲ)(GBW 08666)、砷酸根離子As(Ⅴ)(GBW 08667) 、一甲基砷MMA(Ⅴ)(GBW 08668)、二甲基砷DMA(Ⅴ)(GBW 08669)、砷甜菜堿AsB(GBW 08670)等砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：均由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供；用于總砷含量測(cè)定的環(huán)境校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。

1.2 樣品的采集和保存

將經(jīng)牛黃解毒片暴露30天后的大鼠注射麻藥，取10 mL腹主動(dòng)脈血于離心管中，以5 000 r/min離心10 min，取血清，儲(chǔ)存于-20 ℃，待分析。

1.3 樣品前處理

1.3.1 總砷測(cè)定前處理方法 取0.5 mL放置至室溫的血清樣品于15 mL聚丙烯離心管中，加入4.5 mL 1%硝酸，混勻后采用ICP-MS測(cè)定，同時(shí)制備空白溶液。

1.3.2 砷形態(tài)測(cè)定前處理方法 取0.2 mL放置至室溫的血清樣品于1.5 mL聚丙烯離心管中，加入0.4 mL乙腈，渦旋30 s，采用超聲提取法提取，于60 ℃超聲1.5 h，然后以13 000 r/min離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，用超純水?fù)溶至0.6 mL，同時(shí)制備空白溶液，采用HPLC-ICP-MS測(cè)定。上機(jī)后，向提取液中加入1%過(guò)氧化氫，于60 ℃干燥箱中加熱1 h，然后進(jìn)行HPLC-ICP-MS測(cè)定。

1.4 分析方法

1.4.1 總砷含量測(cè)定 選取同位素75As，以72Ge(1 mg/L)為內(nèi)標(biāo)元素，在線加入內(nèi)標(biāo)溶液，ICP-MS主要參數(shù)列于表1。將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的信號(hào)響應(yīng)值，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)值-離子每秒計(jì)數(shù)值(cps)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ICP-MS測(cè)定總砷含量時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0、0.5、1、5、10、50、100、300、500 μg/L，可根據(jù)待測(cè)樣品中砷的實(shí)際含量適當(dāng)調(diào)整。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定血清中總砷含量采用的濃度為0、0.5、1、5、10、50 μg/L，樣品濃度與質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度成正比。

表1 ICP-MS主要參數(shù)Table 1 Main parameters of ICP-MS

注：a為測(cè)定總砷含量時(shí)的參數(shù)；b為測(cè)定砷形態(tài)時(shí)的參數(shù)；未注明的為通用參數(shù)

1.4.2 砷形態(tài)測(cè)定條件 色譜條件：選取Dionex IonPac AS19柱(250 mm×4 mm×10 μm)作為分析柱；以20 mmol/L碳酸銨(pH 9.7)-3%甲醇溶液為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，等度洗脫，進(jìn)樣量25 μL。

質(zhì)譜條件：采用具有同心霧化器的電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(具碰撞反應(yīng)池)進(jìn)行檢測(cè)；選取同位素75As，以標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器檢測(cè)模式的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了標(biāo)準(zhǔn)模式和氦模式下5種砷形態(tài)化合物的檢出限，結(jié)果列于表2。結(jié)果顯示：在標(biāo)準(zhǔn)模式，AsB、DMA(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA(Ⅴ)和As(Ⅴ)的檢出限分別為0.10、0.10、0.10、0.15、0.15 μg/L；在氦模下分別為0.20、0.20、0.20、0.25、0.25 μg/L?？梢?jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)模式下的檢出限均較低。

實(shí)驗(yàn)還考察了兩種模式對(duì)40Ar35Cl+、75As檢測(cè)信號(hào)的影響。分別配制不同質(zhì)量濃度的氯離子溶液(含5 μg/L 5種砷形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液)，上機(jī)進(jìn)行色譜分析。在標(biāo)準(zhǔn)模式下，當(dāng)氯離子濃度大于或等于600 mg/L時(shí)，在6.44 min出現(xiàn)ArCl干擾峰，示于圖1a。結(jié)果顯示，此峰不干擾待測(cè)的5種砷形態(tài)化合物的測(cè)定，可以忽略。在氦模式下，當(dāng)氯離子濃度為600 mg/L時(shí)，在6.44 min處未出現(xiàn)ArCl干擾峰，結(jié)果示于圖1b。綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行砷形態(tài)化合物的檢測(cè)。

表2 在標(biāo)準(zhǔn)模式和氦模式下，5種砷形態(tài)化合物的檢出限Table 2 Detection limits of five arsenic species under standard mode and He gas mode

圖1 標(biāo)準(zhǔn)模式(a)和氦氣模式(b)下，氯離子濃度為600 mg/L時(shí)，5種砷形態(tài)化合物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of five arsenic species containing 600 mg/L chlorine ion under standard mode (a) and He gas mode (b)

2.2 流動(dòng)相中甲醇濃度的優(yōu)化

據(jù)報(bào)道，有機(jī)溶劑作為基體改進(jìn)劑可以提高第一電離能在9～11 eV的元素的電離效率，尤其是對(duì)于As(9.79 eV)和Se(9.75 eV)[21-23]。在HPLC-ICP-MS技術(shù)中，甲醇已多次被用于增強(qiáng)砷形態(tài)的信號(hào)強(qiáng)度[24-25]。因此，本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相中加入甲醇，并對(duì)添加濃度進(jìn)行優(yōu)化。

分別配制含有0%、1%、2%、3%、4%和5%甲醇的流動(dòng)相，對(duì)5種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)進(jìn)行洗脫，考察甲醇濃度對(duì)5種砷形態(tài)化合物的信號(hào)強(qiáng)度(用積分面積表示)和保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇濃度為4%時(shí)，砷信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最高值；當(dāng)超過(guò)這一濃度時(shí)，砷信號(hào)強(qiáng)度開(kāi)始下降，結(jié)果示于圖2。實(shí)驗(yàn)另表明，AsB和DMA(Ⅴ)的保留時(shí)間幾乎沒(méi)有變化；As(Ⅲ)、MMA(Ⅴ)和As(Ⅴ)的保留時(shí)間隨甲醇濃度的增大而逐漸增大。通過(guò)在線觀察，發(fā)現(xiàn)分析柱的壓力也隨甲醇濃度的增大而增大。

雖然甲醇對(duì)As信號(hào)強(qiáng)度具有增敏作用，但容易在采樣錐和截取錐上產(chǎn)生碳蓄積，長(zhǎng)時(shí)間碳蓄積會(huì)造成錐孔堵塞。綜合考慮信號(hào)強(qiáng)度、分析時(shí)間、儀器損害等方面的因素，選擇3%甲醇作為增敏劑。此時(shí)，AsB、DMA(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA(Ⅴ)和As(Ⅴ)的檢出限分別為0.05、0.05、0.08、0.10和0.10 μg/L。

圖2 流動(dòng)相中甲醇濃度對(duì)5種砷形態(tài)化合物信號(hào)強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of methanol concentration in mobile phase on signal intensity of arsenic species

2.3 血清中砷形態(tài)的定性

在血清中，除了檢測(cè)出AsB和DMA(Ⅴ)，還有兩種未知砷化物，其色譜圖示于圖3。未知砷化物1(U1)出現(xiàn)在As(Ⅲ)出峰位置附近，此峰的保留時(shí)間為4.3 min，而As(Ⅲ)的保留時(shí)間為3.9 min，基本可以確認(rèn)此峰不是As(Ⅲ)。未知砷化物2(U2)的保留時(shí)間為8.0 min。為了進(jìn)一步確認(rèn)未知化合物，向血清提取液中加入與U1峰面積相當(dāng)?shù)腁s(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)參考文獻(xiàn)[26]的方法對(duì)未加標(biāo)的血清提取液進(jìn)行氧化實(shí)驗(yàn)。

圖3 5種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及血清中砷形態(tài)氧化前后對(duì)比色譜圖Fig.3 Chromatogram of five arsenic species standard solution, sample solution before and after oxidation

經(jīng)多次試驗(yàn)表明，As(Ⅲ)和U1化合物的保留時(shí)間有明顯差異，部分產(chǎn)生了重疊。氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化后U1峰和U2峰消失，氧化后DMA(Ⅴ)的峰面積與氧化前DMA(Ⅴ)的峰面積和U1峰面積的總和相吻合，同時(shí)未檢出As(Ⅴ)，結(jié)果示于圖3和表2。由此可推斷，U1化合物可能為DMA(Ⅲ)，U2化合物尚不能確定。因此，可采用DMA(Ⅴ)氧化前后濃度的變化值作為U1濃度值。

表3 血清中各砷形態(tài)氧化前后的峰面積Table 3 Peak areas of arsenic species in blood serum before oxidation and after oxidation

2.4 前處理方法的優(yōu)化

2.4.1 提取劑的選擇 選擇一份經(jīng)牛黃解毒片暴露30天后的大鼠血清樣品進(jìn)行前處理優(yōu)化試驗(yàn)，通過(guò)ICP-MS測(cè)定其總砷含量為43.02 μg/L，以提取后各砷形態(tài)含量的總和與總砷含量的比值為提取效率考察該提取方法的能力。

文獻(xiàn)中多采用水稀釋[13]、甲醇[27]或乙腈[13]沉淀蛋白后，離心過(guò)膜上機(jī)測(cè)定的方法。1%硝酸作為一種提取劑常用于大米中砷形態(tài)的提取。因此，本實(shí)驗(yàn)采用直接離心的方法分別考察了水、甲醇、乙腈和1%硝酸作為提取劑對(duì)血清中砷形態(tài)提取效果的影響，結(jié)果示于圖4。結(jié)果顯示，不同提取劑的提取效率為：1%硝酸(75.7%)>乙腈(9.3%)>甲醇(8.5%)>水(7.7%)。但1%硝酸作為提取劑時(shí)，在五價(jià)砷出峰位置出現(xiàn)了幾個(gè)雜峰，導(dǎo)致五價(jià)砷不能準(zhǔn)確定量。水和1%硝酸沉淀蛋白能力弱，不能有效除去蛋白，會(huì)導(dǎo)致蛋白在分析柱上積累而造成堵塞。而甲醇和乙腈具有很強(qiáng)的沉淀蛋白能力，乙腈的提取效率要高于甲醇的提取效率。綜合考慮，選擇乙腈作為沉淀劑和提取劑為宜。但按照文獻(xiàn)中直接離心的處理方法，砷形態(tài)的測(cè)定結(jié)果只占總砷含量的10%左右。因此，需要進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件來(lái)提高砷形態(tài)的提取效率。

2.4.2 提取方法的選擇 以乙腈為提取劑，對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化選擇。本實(shí)驗(yàn)分別采用直接離心、60 ℃加熱提取1 h和60 ℃水浴超聲提取1 h對(duì)血清中砷形態(tài)進(jìn)行提取，結(jié)果示于圖5。結(jié)果顯示，不同提取方法的提取效率為：水浴超聲提取>加熱提取>直接離心。因此，選擇水浴超聲提取作為本實(shí)驗(yàn)的提取方法。

注：a.各砷形態(tài)含量；b.提取效率圖4 不同提取劑對(duì)血清中砷形態(tài)的提取效果Fig.4 Effect of different extractants on the extraction of arsenic species in serum

圖5 不同提取方法對(duì)血清中砷形態(tài)的提取效果Fig.5 Effect of different extraction methods on the extraction of arsenic species in serum

2.4.3 提取溫度和提取時(shí)間的優(yōu)化 將水浴超聲提取時(shí)間設(shè)為30 min，對(duì)提取溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果示于圖6。結(jié)果顯示，提取效率隨提取溫度的升高而提高。當(dāng)提取溫度為60 ℃或者更高時(shí)，提取效率基本保持不變；但提取溫度為60 ℃時(shí)，U1的測(cè)定值達(dá)到最大值；提取溫度高于60 ℃時(shí)，U1的測(cè)定值開(kāi)始下降，DMA(Ⅴ)的測(cè)定值升高。這說(shuō)明提取溫度高于60 ℃時(shí)，部分U1可能轉(zhuǎn)化為DMA(Ⅴ)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇的提取溫度為60 ℃。

將水浴超聲提取溫度設(shè)為60 ℃，對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果示于圖7。結(jié)果表明，提取時(shí)間為90 min時(shí)，提取效率最佳，同時(shí)U1的濃度也相對(duì)較高。

提取條件最佳時(shí)，提取效率約為73.4%。因此，推測(cè)一部分砷形態(tài)隨蛋白沉淀被帶走，于是對(duì)血清沉淀蛋白中的砷進(jìn)行考察。將沉淀的蛋白轉(zhuǎn)移至10 mL小燒杯中，加入2 mL硝酸和1 mL過(guò)氧化氫，于電熱板上進(jìn)行消解，消解完成后趕酸至近干，用2 mL超純水復(fù)溶，同時(shí)做全程空白，采用ICP-MS測(cè)定消解液的總砷含量。結(jié)果顯示，沉淀的蛋白中總砷含量占血清中總砷含量的19.8%。沉淀的蛋白中總砷含量與提取的總砷形態(tài)含量之和占血清中總砷含量的93.2%，這與之前的推斷相吻合。

2.5 方法的線性范圍及檢出限

分別配制0.5、1、5、10、50、100、200、300 μg/L 5種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)系列，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析，在0.5～300 μg/L 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(R2) 均大于0.999，結(jié)果列于表4。采用逐級(jí)稀釋法，將待測(cè)物的信噪比(S/N)大于或等于3時(shí)的濃度確定為該化合物的檢出限。AsB、DMA(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA(Ⅴ)和As(Ⅴ)的檢出限分別為0.05、0.05、0.08、0.10和0.10 μg/L。

注：a.各砷形態(tài)含量；b.提取效率圖6 提取溫度對(duì)血清中砷形態(tài)提取效果的影響Fig.6 Effect of different extraction temperatures on the extraction of arsenic species in serum

注：a.各砷形態(tài)含量；b.提取效率圖7 提取時(shí)間對(duì)血清中砷形態(tài)提取效果的影響Fig.7 Effect of different extraction times on the extraction of arsenic species in serum

表4 方法的線性范圍及檢出限
Table 4 Linear ranges and limit of detections of the method

分析物Compounds線性范圍Linearranges/(μg/L)線性方程Linearequations相關(guān)系數(shù)R2檢出限Limitofdetections/(μg/L)AsB0.5～300y=33069.2x-16553.50.99970.05DMA(Ⅴ)0.5～300y=36110.7x-8083.70.99980.05As(Ⅲ)0.5～300y=29900.6x+1652.71.00000.08MMA(Ⅴ)0.5～300y=34691.7x-31515.50.99990.10As(Ⅴ)0.5～300y=27348.8x-6594.01.00000.10

2.6 方法的準(zhǔn)確性及重復(fù)性

以加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確性，以精密度實(shí)驗(yàn)考察重復(fù)性。加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在前處理過(guò)程中，有一部分As(Ⅲ)轉(zhuǎn)化成As(Ⅴ)，但As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的總量保持不變。因此，以無(wú)機(jī)砷(包含三價(jià)砷和五價(jià)砷，簡(jiǎn)稱iAs)、AsB、DMA(Ⅴ)、MMA(Ⅴ)對(duì)實(shí)驗(yàn)的精密度和加標(biāo)回收率進(jìn)行考察。向血清樣品中分別加入3個(gè)質(zhì)量濃度水平的AsB、As(Ⅲ)、DMA(Ⅴ)、MMA(Ⅴ)、As(Ⅴ)5種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成6個(gè)模擬樣品，進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果列于表5。AsB、DMA(Ⅴ)、MMA(Ⅴ)、無(wú)機(jī)砷的加標(biāo)回收率在86.3%～109.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于5%。

2.7 血清樣品中砷形態(tài)分析

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，分析經(jīng)牛黃解毒片暴露30天后8個(gè)大鼠血清中砷形態(tài)，結(jié)果列于表6。可見(jiàn)，在經(jīng)牛黃解毒片暴露30天后的大鼠血清中檢測(cè)出AsB、DMA(Ⅴ)、U1和U2，未檢出其他砷形態(tài)。所測(cè)血清樣品中AsB、DMA(Ⅴ)和U1的含量范圍分別為1.65～2.02、10.4～31.8和4.77～13.0 μg/L；提取效率在62.7%～69.5%之間。樣品Y8中砷形態(tài)氧化前后對(duì)照?qǐng)D示于圖8。

為了探究大鼠血清中AsB的來(lái)源，分別對(duì)牛黃解毒片和飼養(yǎng)大鼠飼料中的砷形態(tài)進(jìn)行分析。測(cè)定結(jié)果顯示，牛黃解毒片中砷形態(tài)主要為As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，含量分別為189.7 mg/kg和53.1 mg/kg。飼料中檢出少量的砷形態(tài)，包括AsB、DMA(Ⅴ)、As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，含量分別為0.056、0.006、0.029和0.045 mg/kg。由此可知，大鼠血清中AsB可能來(lái)源于飼料。

表5 方法的精密度和加標(biāo)回收率(n=6)Table 5 Precisions and standard addition recoveries of the method (n=6)

表6 大鼠血清中砷形態(tài)Table 6 Arsenic species in rat serum

注：沉淀蛋白總砷為蛋白沉淀中總砷折算成血清中砷的含量

圖8 樣品Y8中砷形態(tài)氧化前后對(duì)照?qǐng)DFig.8 Chromatogram of arsenic species in Y8 sample before and after oxidation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)經(jīng)牛黃解毒片暴露后大鼠血清中的砷形態(tài)進(jìn)行了初步研究。通過(guò)優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜和前處理等條件，分析了血清中砷形態(tài)。結(jié)果顯示，經(jīng)牛黃解毒片暴露后大鼠血清中檢出AsB、DMA(Ⅴ)、U1和U2，其中DMA(Ⅴ)和U1為經(jīng)牛黃解毒片暴露后主要的代謝產(chǎn)物，少量的AsB來(lái)源于飼料，此結(jié)果可為進(jìn)一步探究牛黃解毒片在生物體內(nèi)的代謝研究提供技術(shù)支持。

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Arsenic Species in Rat Serum after Oral Administration of Niuhuang Jiedu Tablet by HPLC-ICP-MS

CHEN Shao-zhan1, LIU Li-ping1,2, DU Hong-ju1, JIN Peng-fei3, ZHOU Tian-hui1

(1.BeijingCenterforDiseasePreventionandControl,Beijing100013,China;2.SchoolofPublicHealth,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;3.BeijingHospital,Beijing100730,China)

The preliminary study of arsenic species in rat serum after oral administration of Niuhuang Jiedu tablet was established by high performance liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). With acetonitrile as extraction agent, water bath ultrasonic extraction at 60 ℃ was used as the pretreatment of serum samples. The extracting solution was separated by centrifugation at 13 000 r/min for 10 min, then filtered through 0.45 μm membrane. 20 mmol/L (NH4)2CO3(pH 9.7) and 3% methanol were used as mobile phase, and Dionex IonPac AS19 (250 mm×4 mm×10 μm) was used as analytical column for analysis of arsenic species in rat serum after oral administration of Niuhuang Jiedu tablet. Experimental results show that the detection limits of AsB, DMA(Ⅴ), As(Ⅲ), MMA(Ⅴ) and As(Ⅴ) are 0.05, 0.05, 0.08, 0.10 and 0.10 μg/L, respectively. The linear coefficients (R2) are more than 0.999, the recoveries are between 86.3% and 109.2% with the relative standard deviation less than 5%. The preliminary study found that DMA(Ⅴ) and U1 are the main arsenic species in rat serum after oral administration of Niuhuang Jiedu tablet, and a small amount of AsB and U2 are also detected in rat serum. The method is sensitive and high extraction efficiency, which can realize the simultaneous separation of various known and unknown arsenic forms, and provide technical support for the metabolic study of arsenic in rat blood.

high performance liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS); Niuhuang Jiedu tablet; serum; arsenic species

2016-06-13;

2016-10-17

國(guó)家自然科學(xué)基金青年課題(81308216)資助

陳紹占(1987—)，男(漢族)，河北邯鄲人，碩士研究生，從事無(wú)機(jī)元素分析及形態(tài)研究。E-mail: csz1987buct@163.com

劉麗萍(1965—)，女(漢族)，北京人，教授，從事元素及形態(tài)分析研究。E-mail: llp9312@163.com

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0177-10

10.7538/zpxb.2016.0089