雷 丹，韓 迪，蔣德意，甘 聃

(潤(rùn)盈生物(上海)有限公司，上海 201700)

瑞士乳桿菌LH-G51凍干菌粉生產(chǎn)工藝研究

雷 丹，韓 迪，蔣德意，甘 聃

(潤(rùn)盈生物(上海)有限公司，上海 201700)

目的：對(duì)瑞士乳桿菌LH-G51菌粉生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定適合LH-G51生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基、凍干保護(hù)劑配方及生產(chǎn)工藝。結(jié)果：發(fā)酵時(shí)間、碳氮源及微量元素添加量均對(duì)LH-G51生長(zhǎng)有明顯影響。最終確定LH-G51培養(yǎng)基碳氮源及微量元素為葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、酵母膏15 g/L、MgSO4·7H2O為250 mg/L、MnSO4·H2O為50 mg/L、發(fā)酵時(shí)間10 h、保護(hù)劑為B。結(jié)論：根據(jù)優(yōu)化工藝，LH-G51凍干菌粉活菌數(shù)可達(dá)到4.21×1011CFU/g。

瑞士乳桿菌；生產(chǎn)工藝；保護(hù)劑；凍干菌粉

瑞士乳桿菌是人體腸道內(nèi)的一種益生菌，也是干酪制品中常用的乳酸菌發(fā)酵劑[1]，因其能產(chǎn)生多種活性肽以及胞外蛋白酶能優(yōu)先水解α-CN 和β-CN，故其發(fā)酵乳有降血壓、抑制腫瘤、降膽固醇等作用[2-5]。食用此菌發(fā)酵酸乳能促進(jìn)鈣的吸收，增加骨密度和骨礦物質(zhì)含量減少骨質(zhì)流失[6-7]。由于瑞士乳桿菌具有這些益生保健功能，使得此菌具有較好的應(yīng)用市場(chǎng)，因此提高其產(chǎn)量以及菌粉活菌含量比較具有研究意義。

有研究表明，瑞士乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中極易自溶，不適于冷凍干燥制備發(fā)酵劑[8-9]，本研究針對(duì)分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶酪中的一株瑞士乳桿菌LH-G51，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基、保護(hù)劑進(jìn)行篩選，并進(jìn)行小試驗(yàn)證及工藝優(yōu)化，來(lái)提高其凍干菌粉活菌數(shù)，再進(jìn)行中試放大，為后續(xù)瑞士乳桿菌的生產(chǎn)應(yīng)用提供重要的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 瑞士乳桿菌LH-G51，由潤(rùn)盈生物工程(上海)有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 MRS：葡萄糖 20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸氫二胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.19 g/L、吐溫-80 1 g/L。

1.1.3 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 MRS，0.8 g/L瓊脂粉。

1.1.4 冷凍干燥保護(hù)劑 選取工廠生產(chǎn)所用5種乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑A、B、C、D、E(表1)。

表1 瑞士乳桿菌LH-G51凍干保護(hù)劑主要成分 單位：g/L

1.2 儀器與設(shè)備

15 L、100 L全自動(dòng)機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，上海佰侖公司；UV-2102C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；FD8-6型真空冷凍干燥機(jī)，上海穎漢化工；冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與接種發(fā)酵 將真空冷凍保藏的LH-G51菌株接種于MRS培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)12 h，并傳代2次。按照3%的接種量接種，接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況。

1.3.2 菌濃度測(cè)定 取1 mL發(fā)酵液稀釋至一定濃度，于600 nm下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。

1.3.3 活菌檢測(cè) 采用平板傾注法，取0.5 mL(或0.5 g)待測(cè)樣品溶解于4.5 mL無(wú)菌生理鹽水中震蕩均勻，梯度稀釋至一定濃度后傾注平板，每個(gè)梯度取3個(gè)平行樣，37℃培養(yǎng)48h后統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)。

1.3.4 凍干粉制備 發(fā)酵結(jié)束后，采用冷凍離心機(jī)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心條件：溫度4℃、轉(zhuǎn)速7 000 r/min、時(shí)間10 min，離心后菌泥和保護(hù)劑按照1∶2進(jìn)行乳化及真空冷凍干燥，凍干機(jī)參數(shù)為：冷阱溫度-80℃，真空度1 mTorr。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

將分離得到的乳桿菌LH-G51進(jìn)行培養(yǎng)以及生理生化鑒定，觀察菌落形態(tài)和菌體形態(tài)，初步確定LH-G51為瑞士乳桿菌。

取LH-G51培養(yǎng)液提取細(xì)菌總DNA，擴(kuò)增16S rRNA基因，測(cè)定PCR 產(chǎn)物全序列，測(cè)得序列進(jìn)行Blast比對(duì)，圖1結(jié)果顯示，該菌株與GenBank中的瑞士乳桿菌CNRZ32相似性為99%，確定乳酸菌LH-G51為瑞士乳桿菌。

圖1 LH-G51和瑞士乳桿菌CNRZ32的BLAST比對(duì)

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 不同碳氮源對(duì)LH-G51的影響 碳源及氮源對(duì)乳酸菌有著重要作用，是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的基礎(chǔ)，為乳酸菌生長(zhǎng)繁殖提供能量來(lái)源，氮源也是組成乳酸菌蛋白質(zhì)和核酸的核心元素[10]。本研究在基礎(chǔ)培養(yǎng)基MRS的基礎(chǔ)上，碳氮源添加量不變，改變碳源及氮源的種類進(jìn)行發(fā)酵。由圖2(A)可知，以葡萄糖為單一碳源時(shí)生長(zhǎng)效果優(yōu)于其他3種碳源，因此選用葡萄糖為L(zhǎng)H-G51培養(yǎng)的最優(yōu)碳源。由圖2(B)可知，不同氮源對(duì)LH-G51的生長(zhǎng)影響顯著，酵母膏及大豆蛋白胨對(duì)促進(jìn)LH-G51的生長(zhǎng)效果最明顯，其原因可能是這兩種氮源物質(zhì)中的氮是以氨基酸、肽小分子形式存在，因此在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中更容易被利用吸收[11]。A.Amrane的研究[12]也證明，培養(yǎng)基中提高酵母膏的添加量能促進(jìn)瑞士乳桿菌的生長(zhǎng)。

注：(A)圖中，a-乳糖、b-葡萄糖、c-蔗糖、d-低聚半乳糖；(B)圖中，A-酵母膏、B-蛋白胨、C-牛肉浸粉、D-胰蛋白胨、E-大豆蛋白胨、F-MRS對(duì)照?qǐng)D2 不同碳氮源培養(yǎng)基對(duì)LH-G51生長(zhǎng)的影響

圖3 不同微量元素對(duì)LH-G51生長(zhǎng)的影響

2.2.2 碳氮源添加量正交試驗(yàn) 以對(duì)LH-G51生長(zhǎng)促進(jìn)作用較大的葡萄糖、大豆蛋白胨和酵母膏為因素，采用L9(33)正交試驗(yàn)，優(yōu)化此三種成分的添加量，以活菌數(shù)為判斷指標(biāo)，因素水平表見(jiàn)表2。從表3中的極差分析結(jié)果可知：根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果所得到的優(yōu)化復(fù)合碳氮源配比為A2B3C1，即大豆蛋白胨10、酵母膏15 g/L、葡萄糖20 g/L。

表2 正交試驗(yàn)因素水平 單位：g/L

2.2.3 微量元素對(duì)LH-G51的影響 Mg、Mn、Fe、Cu、Zn等某些微量元素是微生物活性物質(zhì)構(gòu)成的重要成分之一，在其代謝過(guò)程中這些微量元素還能夠激活微生物菌體內(nèi)的酶類物質(zhì)，且不同菌株對(duì)微量元素的需求不同[13-14]，因此需對(duì)其添加種類及添加量進(jìn)行優(yōu)化。由圖3可以看出，添加不同量不同種的無(wú)機(jī)鹽對(duì)LH-G51發(fā)酵液的活菌數(shù)有不同影響，Cu2+對(duì)LH-G51有抑制作用，F(xiàn)e2+、Zn2+促進(jìn)作用不明顯，Mg2+、Mn2+對(duì)LH-G51的生長(zhǎng)具有較明顯促進(jìn)作用，其中，MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O的最適添加量分別為 250、50mg/L。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 LH-G51凍干保護(hù)劑篩選

發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液離心所得到菌泥，按照表1中的5種保護(hù)劑進(jìn)行乳化及凍干，由表4、表5可知，采用保護(hù)劑B乳化凍干的LH-G51菌粉活菌數(shù)最高，通過(guò)方差分析及Dun-can新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較可知，保護(hù)劑B與其他4種保護(hù)劑差異極顯著，因此，選用保護(hù)劑B配方為L(zhǎng)H-G51的較優(yōu)保護(hù)劑。

表4 5種凍干保護(hù)劑凍干LH-G51菌粉檢測(cè)結(jié)果

注：標(biāo)有同一字母的數(shù)據(jù)間差異不顯著；方差分析采用Dun-can新復(fù)極差法

表5 5種凍干保護(hù)劑凍干LH-G51菌粉方差分析

注：F0.05(3，4)=5.192

2.4 LH-G51生產(chǎn)工藝研究

2.4.1 LH-G51在優(yōu)化的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性 采用優(yōu)化的培養(yǎng)基對(duì)LH-G51進(jìn)行15L發(fā)酵罐小試試驗(yàn)驗(yàn)證以及發(fā)酵工藝優(yōu)化，選擇合適的發(fā)酵參數(shù)；再進(jìn)行100L發(fā)酵罐中試放大，發(fā)酵過(guò)程中恒控pH 5.8±0.1。發(fā)酵參數(shù)為：罐溫37±1℃，通氮?dú)獗海迚?.02～0.05MPa，接種后每隔1 h取樣檢測(cè)LH-G51生長(zhǎng)情況及發(fā)酵液活菌數(shù)，繪制LH-G51的生長(zhǎng)曲線。由圖4可以看出，LH-G51在優(yōu)化的培養(yǎng)基及工藝條件下發(fā)酵，菌濃度在10 h達(dá)到最大值，此時(shí)OD600值為10.18，發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到4.36×109CFU/mL，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖4 瑞士乳桿菌LH-G51在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)曲線

2.4.2 LH-G51放罐時(shí)間的選擇 為了保證得到活性最高的凍干菌粉，從發(fā)酵9 h開(kāi)始，每隔1 h取發(fā)酵液樣品進(jìn)行離心、乳化及凍干，得到瑞士乳桿菌LH-G51的凍干菌粉，對(duì)菌粉進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，由表6、表7檢測(cè)結(jié)果及方差分析數(shù)據(jù)可知，9～11 h所得菌粉樣品的活菌數(shù)相當(dāng)，12 h后活菌數(shù)下降，考慮到生產(chǎn)成本以及菌泥產(chǎn)量，選擇10 h即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期進(jìn)行放罐收獲比較合適，提前放罐收率減低，推遲放罐菌會(huì)老化從而導(dǎo)致菌粉活力及穩(wěn)定性下降。

表6 瑞士乳桿菌LH-G51不同取樣時(shí)間凍干菌粉活菌數(shù)

表7 5種凍干保護(hù)劑凍干LH-G51菌粉方差分析

注：F0.05(3，4)=6.591

3 結(jié)論

單因素及正交試驗(yàn)確定LH-G51最適培養(yǎng)基(/L)：葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母膏15 g、無(wú)水乙酸鈉5 g、K2HPO42 g、檸檬酸氫二銨2 g、MgSO4·7H2O 250 mg、MnSO4·5H2O 50 mg、Tween-80 1 g。LH-G51在此培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)小試15 L發(fā)酵罐優(yōu)化工藝后，于100 L發(fā)酵罐中進(jìn)行中試，通氮?dú)獗?，罐?.02～0.05 MPa，罐溫37±1℃，恒控 pH5.8±0.1，培養(yǎng)10 h后培養(yǎng)基活菌數(shù)可達(dá)到4.36×109CFU/mL。此時(shí)放罐所得的菌泥采用優(yōu)化的保護(hù)劑B進(jìn)行乳化凍干，得到凍干菌粉活菌數(shù)為4.21×1011CFU/g，比在MRS中培養(yǎng)所得的菌粉(8.6×1010CFU/g)提高了近5倍，為瑞士乳桿菌凍干菌粉進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Production Process of Lyophilized Powder forLactobacillushelveticusLH-G51

LEI Dan，HAN Di，JIANG De-yi，GAN Dan

(BIOGROWING (SHANGHAI)CO.，LTD，Shanghai 201700,China)

ObjectiveTo optimize the production process of freeze-dried powder ofLactobacillushelveticusLH-G51.Method Optimized conditions for fermentation medium formula，freeze-drying protective agents and production processing were screened by using single factor and orthogonal experimental design.ResultAmong different factors，carbon sources，nitrogen sources and micro-elements were the key factors during the cell culture stage.The optimal culture medium for LH-G51 was glucose 20 g/L，soy peptone 10 g/L，yeast extract 15 g/L，MgSO4·7H2O 250 mg/L，MnSO4·H2O 50mg/L，the best protective agents was B.ConclusionUnder the optical conditions，the cell number of lyophilized powder of LH-G51 reached up to 4.21×1011CFU/g。

Lactobacillushelveticus；production process；protective agents；lyophilized powder

雷丹(1983— )，女，碩士，研發(fā)工程師，研究方向：益生菌制備工藝。

甘聃(1981— )，男，博士，技術(shù)研發(fā)總監(jiān)，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與健康。