(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，成都610039)

降膽固醇植物乳桿菌I4菌在酸奶中的應(yīng)用

朱奇奇，張馳翔，王周，蒲博，焦士蓉

(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，成都610039)

由于降膽固醇植物乳桿菌I4菌具有良好的功能特性，為了更好地發(fā)揮其益生作用，對I4菌與商業(yè)酸奶益生菌進(jìn)行復(fù)配，利用響應(yīng)面對復(fù)配參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對酸奶21 d內(nèi)的微生物含量、理化指標(biāo)和降膽固醇率進(jìn)行測定。結(jié)果表明：以商業(yè)益生菌與I4菌粉比例為1∶1，發(fā)酵時間10.6 h，發(fā)酵溫度40.9℃，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.1%，后發(fā)酵時間16 h進(jìn)行發(fā)酵，酸奶感官評分最高。4℃冷藏21 d間乳酸菌數(shù)為4.01×109～4.45×109mL-1，pH值為4～4.28、滴定酸度為72～88oT，持水力為73.3%～80%、乳清析出率為2.1%～8.3%，黏度為407～434 mPa·s，硬度為129.96～221.34 g。通過對復(fù)配后發(fā)酵的酸奶進(jìn)行降膽固醇能力的測試，得出膽固醇降解率為43.6%±0.82%。

降膽固醇植物乳桿菌；酸奶；響應(yīng)面優(yōu)化；

0 引言

發(fā)酵乳制品是益生菌最重要的載體之一，益生菌作為附屬發(fā)酵劑添加到發(fā)酵乳制品中，不僅可以增加發(fā)酵乳制品的保健功效，而且還可以改善其品質(zhì)，賦予其獨(dú)特的風(fēng)味[1]。作為食物的添加劑，益生菌還能夠增強(qiáng)食品的健康特性，提高產(chǎn)品的消費(fèi)價值。目前投入市場的益生菌發(fā)酵乳制品種類很多，其中包括：含益生菌的酸牛奶、酸乳酪、酸豆奶以及含多種益生菌的口服液、片劑、膠囊、粉末劑等[2]。

本研究試驗菌株L.plantarum I4由四川泡菜中分離得到，經(jīng)研究表明該菌株具有良好的耐酸性及膽鹽耐受性，對免疫系統(tǒng)具有顯著的調(diào)節(jié)功能[3]；經(jīng)體外試驗表明，該菌株具有較好的抗氧化作用及降膽固醇功效[12]。因此，本章研究的目的在于通過與商業(yè)用酸奶益生菌進(jìn)行復(fù)配，并對乳中發(fā)酵特性進(jìn)行評價，為進(jìn)一步開發(fā)益生菌發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1材料與儀器

降膽固醇植物乳桿菌I4菌，新希望純牛奶，蔗糖，益生優(yōu)酸奶益生菌，鄰苯二甲醛，膽固醇。

電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱，UV-2600型紫外可見分光光度計，PEN3電子鼻，NDJ-5S旋轉(zhuǎn)黏度計，TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀。

1.2方法

1.2.1 酸奶的發(fā)酵工藝

純牛奶→添加白砂糖→接種→混合均勻→發(fā)酵→冷藏后熟（4℃）→發(fā)酵乳→檢驗分析

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計

通過單因素實驗（未發(fā)表），探討各因素在酸奶口感的影響大小。以感官評定指標(biāo)為響應(yīng)值，選發(fā)發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度以及蔗糖濃度這3個作用最顯著的因素，在發(fā)酵粉與I4菌粉比例為1∶1、后發(fā)酵時間16 h的條件下。設(shè)計Box-Behnken實驗。采用Design Expert8.05 b軟件輔助實驗，實驗因素水平及編碼值如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計實驗因素水平及編碼

1.2.3 感官指標(biāo)評定

由本實驗室成員成立一個15人感官評定小組，經(jīng)過對酸奶感官評定課程的培訓(xùn)，基本掌握酸奶的感官分析方法。評分標(biāo)準(zhǔn)采用百分制。對酸奶樣品的芳香味、氣味、口感、表觀以及黏稠度進(jìn)行打分，評定標(biāo)準(zhǔn)如表2所示[4]。

表2 酸奶感官評分

1.2.4 酸奶樣品的微生物及理化測定

利用單因素試驗優(yōu)化的工藝參數(shù)生產(chǎn)酸奶,發(fā)酵結(jié)束后在貯藏溫度為4℃的條件下貯藏。分別在酸奶樣品冷藏期的第1，7，14，21 d取樣，進(jìn)行微生物和理化指標(biāo)的測定。

⑴微生物指標(biāo)測定。采用GB 478935-2010的方法測定乳酸菌的菌落數(shù)。

⑵理化指標(biāo)測定。

①pH測定采用PHS-3C型精密pH計測定樣品的pH值。

②滴定酸度的測定根據(jù)國標(biāo)GB 541334-2010測定。

③持水力的測定。菌株持水能力采用KEOGH[6]等研究方法，并略作改動。取發(fā)酵乳樣品5.0 g，離心（3 000 g，10 min）。收集上清液稱重。按下列公式計算酸奶的持水性：

持水能力（%）=（沉淀重g/樣品重量g）×100%

④自發(fā)乳清析出情況。酸奶自4℃冰箱取出后，稱酸奶質(zhì)量（W1），而后將酸奶杯傾斜45°，10 s內(nèi)吸出表面的乳清，再稱取酸奶的質(zhì)量（W2）。酸奶杯與膜質(zhì)量記為（W0）。

自發(fā)乳清析出=(W1-W2)/(W1-W0)

⑤凝膠強(qiáng)度和黏度的測定。將酸奶樣品于室溫(25℃)下回復(fù)一段時間，選用錐形探頭36 R，下壓模式，穿入未經(jīng)攪拌的酸奶，插入深度15 mm，下降速度與測試速度為1.0 mm/s，提升速度為2.0 mm/s，測試深度15.0 mm，記錄探入過程中所需的應(yīng)力（g）[7]。此過程所需最大的力即為酸奶的凝膠強(qiáng)度[8]，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

將酸奶樣品于室溫(25℃)下回復(fù)一段時間，用玻璃棒順時針、逆時針各攪拌20下，使酸奶樣品均勻，選用LV3轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速60 r/min，測試時間1 min，每隔5 s取一個測試值，測定攪拌后的酸奶黏度。

發(fā)酵酸奶降膽固醇能力的測定參考文獻(xiàn)[9-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1響應(yīng)面實驗結(jié)果及分析

選取對酸奶感官質(zhì)量影響較大的發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度以及蔗糖濃度這3個因素做Box-Behnken設(shè)計，并且以感官質(zhì)量評分作為響應(yīng)值，設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果

利用Design Expert 8.05 b軟件對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得回歸模型方差分析，結(jié)果如表4所示。

對表4回歸模型方差分析，實驗所選用模型P值＜0.0001，極顯著，說明不同因子與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系是極顯著的，同時試驗方法也是可靠的。失擬項P值為0.146，不顯著(P＞0.05)，說明該方程對實驗擬合情況好，可用該方法對各因素條件下的酸奶感官進(jìn)行預(yù)測。本研究R2=0.9771，即響應(yīng)值有97.71%來源于所選變量的變化，也即該方程擬合度好。變異系數(shù)為2.78，說明實驗可靠性良好

表4 回歸模型方差分析

三個因子經(jīng)過擬合，得到二次多項回歸方程為

R=86.40+6.50A+3.50B+0.50C+0.50AB-0.50AC+ 0.50BC-11.45A2-4.45B2-6.45C2。

根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析圖，如圖1～圖3所示。

圖1 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對酸奶感官評分的影響

圖1為在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對酸奶感官評分的交互影響效應(yīng)。由圖1可以看出，發(fā)酵溫度對酸奶感官評分影響較小，表現(xiàn)為曲線較平滑，而發(fā)酵時間的影響則較大，表現(xiàn)為曲線較為陡峭。發(fā)酵時間的等高線較密，說明發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度對酸奶感官評分的交互效應(yīng)比較顯著。

圖2 發(fā)酵時間和蔗糖濃度對酸奶感官評分的影響

圖2為發(fā)酵溫度40℃時，發(fā)酵時間與蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酸奶感官評分的交互影響。由圖2可以看出，發(fā)酵時間對酸奶感官評分影響較大，表現(xiàn)為曲線較陡峭，同時也可看到，這兩者的交互影響較為顯著。

圖3 發(fā)酵溫度和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酸奶感官評分的影響

圖3為發(fā)酵時間10 h的情況下，發(fā)酵溫度與蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酸奶感官評分的交互影響。由圖3可以看出，說明發(fā)酵溫度對酸奶感官評分影響較大，表現(xiàn)為曲線較陡峭。這兩者的交互影響較為顯著。同時，這也與圖2的結(jié)論一致。發(fā)酵溫度和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酸奶感官評分的影響比較，發(fā)酵溫度影響較為顯著，等高線更接近發(fā)酵溫度。

2.2最佳工藝的預(yù)測和驗證

通過輔助軟件Design Expert，優(yōu)化發(fā)酵條件。得到理論最佳發(fā)酵條件和響應(yīng)數(shù)據(jù)為，發(fā)酵時間10.6 h，發(fā)酵溫度40.9℃，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.1%。進(jìn)行驗證實驗，得到實驗結(jié)果為89。根據(jù)回歸方程，計算得其感官評分預(yù)測值為88.0532。相對誤差為1.1%（小于10%）。證明響應(yīng)面優(yōu)化酸奶工藝是可行的。

2.3微生物指標(biāo)

酸奶樣品在1，7，14，21 d活菌數(shù)檢測結(jié)果如表5所示。

表5 不同天數(shù)活菌數(shù)檢測結(jié)果 mL-1

由表5可知，經(jīng)4℃冷藏，乳酸菌的活菌數(shù)隨著冷藏時間的延長先增加后降低，在7 d時達(dá)到最大為4.45×109cfu mL-1，隨后開始降低，21 d時為 4.01× 109cfu mL-1。遠(yuǎn)高于GB 19302-2010要求的乳酸菌數(shù)大于等于1×106cfu mL-1，表明乳酸菌在酸乳冷藏期間的存活能力較強(qiáng)。本研究中所選用的植物乳桿菌I4菌按1∶1的添加量與商業(yè)發(fā)酵劑益生優(yōu)酸奶益生菌復(fù)配制備的酸奶在4℃冷藏21 d后，其活菌數(shù)達(dá)到了4.01×109cfu mL-1，符合GB 19302-2010要求。

2.4理化指標(biāo)

2.4.1 pH值與滴定酸度

由圖4可以看出，4℃冷藏21 d期間，兩樣品的pH值隨天數(shù)的增加呈下降趨勢，而滴定酸度呈上升趨勢。添加了L.plantarum I4的酸奶樣品中，其pH值和滴定酸度與樣品相比在各個階段差異均不顯著(P＞0.05)，這可能是由于L.plantarum I4在乳中產(chǎn)酸能力較差的原因，進(jìn)而表明添加L.plantarum I4對酸奶冷藏期間的pH值與滴定酸度沒有太大影響，而滴定酸度滴定酸度大于70并呈上升趨勢。符合國標(biāo)GB 19302-2010。

圖4 冷藏期間pH值、滴定酸度變化情況

2.4.2 持水力變化

持水力是酸奶的重要理化指標(biāo)之一，它的大小直接影響著酸奶的組織狀態(tài)。酸奶樣品持水性越好，酸乳凝膠體系中束縛水的含量就越多，在不破乳的情況下更能保持產(chǎn)品較好的風(fēng)味和氣味，使產(chǎn)品口感更佳。酸奶的持水力變化如圖5所示。

圖5 冷藏期間持水率變化情況

由圖5可以看出，酸奶樣品在冷藏期間都表現(xiàn)出了很好的持水力。由圖5可知，兩組酸奶樣品在冷藏期間都表現(xiàn)出了很好的持水力，含有L.plantarum I4酸奶樣品的持水能力略低于商業(yè)發(fā)酵劑樣品，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.4.3 自發(fā)乳清變化、硬度和黏度的變化

由圖6～圖8可以看出，L.plantarum I4對酸奶樣品的凝膠強(qiáng)度和黏度無顯著影響。添加了L.plantarum I4的樣品的凝膠強(qiáng)度略高于商業(yè)發(fā)酵劑的樣品，黏度略低于商業(yè)發(fā)酵劑的樣品，但差異均不顯著(P＞0.05)，兩組樣品均在冷藏7 d時凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值，在7 d后硬度呈下降趨勢。樣品的黏度和乳清析出率在1～14 d冷藏期呈上升趨勢，在14 d后黏度最大，乳清析出率基本不變，到21 d時黏度稍微下降，可能是因為冷藏至21 d時，酸奶的自發(fā)乳清析出比較多，導(dǎo)致黏度下降。

圖6 冷藏期間自發(fā)乳清析出變化情況

圖7 冷藏期間酸奶硬度的變化情況

2.5酸奶降膽固醇能力測定

圖8 冷藏期間酸奶黏度變化情況

通過對酸奶中降膽固醇能力的測試，得出復(fù)配優(yōu)化后酸奶對膽固醇降解率為43.6%±0.82%（n=3），商業(yè)用益生優(yōu)酸奶益生菌發(fā)酵酸奶對膽固醇降解率為14.3%±0.9%（n=3），說明通過復(fù)配優(yōu)化后做益生性發(fā)酵酸奶中具有顯著的降膽固醇效果。

3 結(jié)論

（1）通過Box-Behnken響應(yīng)曲面法實驗，確定了益生性酸奶的的最佳試驗條件為：優(yōu)化發(fā)酵條件得到理論的最佳的發(fā)酵條件和響應(yīng)數(shù)據(jù)為，發(fā)酵粉與I4菌粉比例為1∶1，發(fā)酵時間10.6 h，發(fā)酵溫度40.9℃，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.1%，后發(fā)酵時間16 h。

（2）對響應(yīng)面優(yōu)化后的益生性酸奶進(jìn)行微生物測定，經(jīng)4℃冷藏，乳酸菌數(shù)21 d內(nèi)為4.01×109～4.45× 109mL-1，符合GB 19302-2010要求。

（4）對響應(yīng)面優(yōu)化后的益生性酸奶進(jìn)行理化測定，4℃冷藏21 d期間，酸奶的pH值隨天數(shù)的增加呈下降趨勢，而滴定酸度滴定酸度大于70并呈上升趨勢。符合國標(biāo)GB 19302-2010。4℃冷藏21 d期間持水力為73.3%～80%，乳清析出率為2.1%～8.3%，黏度為407～434 mPa·s和硬度為129.96～221.34 g。表明L. plantarum I4對酸奶樣品的滴定酸度、凝膠強(qiáng)度、持水力等均無不良影響（P＞0.05），所以將其作為附屬菌應(yīng)用到酸奶生產(chǎn)中具有極大的可行性。

（4）通過對酸奶中降膽固醇能力的測試，得出復(fù)配優(yōu)化后酸奶對膽固醇降解率為43.6%±0.82%（n=3），商業(yè)用益生優(yōu)酸奶益生菌發(fā)酵酸奶對膽固醇降解率為14.3%±0.9%（n=3），說明通過復(fù)配優(yōu)化后做益生性發(fā)酵酸奶中具有顯著的降膽固醇效果。

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Study on the application of I4 cholesterol-lowering plant Lactobacillus bacteria in yogurt

ZHU Qiqi,ZHANG Chixiang,WANG Zhou,PU Bo,JIAO Shirong
（School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China）

I4 cholesterol-lowering plant Lactobacillus bacteria has good functional properties,in order to better play a role of prebiotics,to compound with I4 bacteria and commercial probiotic bacteria of yogurt,Using response surface methodology to optimal the composited parameters.We also measured the microbial content,physical and chemical index and the rate of cholesterol-lowering of yogurt within 21 days. The result shows that the optimal sensory properties of fermentation yogurt with commercial probiotics bacteria and I4 bacteria ratio of 1∶1, fermentation time 10.6 h,fermentation temperature 40.9℃,sucrose concentration 8.1%,after fermentation 16 h.4℃ refrigerated within 21 days，the number of Lactic acid bacteria is 4.01×109～4.45×109mL-1,pH is 4～4.28,titratable acidity is 72～88oT,water-holding power is 73.3%～80%,whey separation rate is 2.1%～8.3%,viscosity is 407～434 mPa·s,hardness is 129.96～221.34 g.The test of the cholesterol-lowering ability of fermented yogurt of optimal composited parameters indicates rate of 43.6%±0.82%.

cholesterol-lowering plant Lactobacillus;yogurt;response surface methodology

TS252.1；TS252.54

A

1001-2230（2017）02-0012-05

2016-09-13

西華大學(xué)省級重點(diǎn)試驗室開放研究基金項目（szjj2014-009)；教育部春暉計劃（12205543）；西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助（ycjj2015025)。

朱奇奇(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為食品領(lǐng)域。

焦士蓉