祝 婕，王 萌，朱 彥

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

藤黃酸的心臟毒性及其基于細(xì)胞表型的多指標(biāo)量化表征

祝 婕1，2，王 萌1，2，朱 彥1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

目的建立基于細(xì)胞表型心臟毒性多指標(biāo)同步量化表征方法，評價(jià)廣譜抗癌藥藤黃酸的心臟毒性。方法采用H9c2心肌細(xì)胞系，以多柔比星（Dox）和胺碘酮（Ami）為陽性藥對照，1‰DMSO為溶劑對照組，次烏頭堿為陰性對照組，應(yīng)用高內(nèi)涵分析多通道活細(xì)胞成像，收集細(xì)胞形態(tài)變化以及各指標(biāo)探針的熒光強(qiáng)度，考察1×10-14～1×10-8mol·L-1濃度范圍藥物對心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞核、線粒體形態(tài)和功能及胞內(nèi)鈣離子含量的影響，以藥物半數(shù)有效量（EC50）判斷藥物對心肌細(xì)胞影響程度，以Z′值判斷所建方法的精密度和假陽性率。結(jié)果Dox降低細(xì)胞數(shù)，導(dǎo)致細(xì)胞核脹大，線粒體質(zhì)量增加，EC50分別為0.72，0.014和1.21 μmol·L-1，且在濃度為10 μmol·L-1時(shí)導(dǎo)致胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。Ami導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)下降，細(xì)胞核縮小及線粒體質(zhì)量減少，EC50值分別為14.83，6.72和4.54 μmol·L-1，高通量篩選Z′值平均為0.5。次烏頭堿對心肌細(xì)胞的細(xì)胞核和胞內(nèi)鈣離子含量無影響，但改變了線粒體的紋理，紋理分析值降低。藤黃酸對心肌細(xì)胞有嚴(yán)重的殺傷作用，使細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞核減小以及胞內(nèi)鈣離子濃度降低，EC50分別為0.24，1.16和0.41 μmol·L-1。藤黃酸使線粒體質(zhì)量降低，線粒體紋理數(shù)值降低以及線粒體面積增加，EC50分別為1.21，0.99和0.44 μmol·L-1。結(jié)論使用高內(nèi)涵分析多通道活細(xì)胞成像技術(shù)所評價(jià)的陽性藥EC50效量和現(xiàn)有報(bào)道接近；多指標(biāo)同步量化對藤黃酸的心臟毒性進(jìn)行了較為全面的分析，并對其毒性作用機(jī)制做出初步的判斷。

心臟毒性；藤黃酸；H9c2細(xì)胞；高內(nèi)涵篩選

目前，抗癌藥物引起引起的心臟毒性成為重點(diǎn)關(guān)注問題，蒽環(huán)類藥物如多柔比星（doxorubicin，Dox）和柔紅霉素等對心肌的主要毒性反應(yīng)的細(xì)胞表征為誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，線粒體DNA損傷，線粒體功能失常以及胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。蒽環(huán)類藥物在臨床使用中因出現(xiàn)嚴(yán)重心臟毒性反應(yīng)而被撤市或限制使用［1-2］。BCR-ABL酪氨酸激酶小分子抑制劑（small molecule tyrosine kinase inhibitors，小分子TKI）如伊馬替尼、達(dá)沙替尼和尼洛替尼等通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力反應(yīng)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［3］。另一類產(chǎn)生心臟毒性的藥物為治療心臟疾病的藥物，如第三類治療心律失常藥鹽酸胺碘酮（amiodarone，Ami），已被美國FDA列入心臟毒性的名單中。因此，藥物的臨床前心臟毒性安全性評價(jià)及預(yù)測不僅減少不必要的經(jīng)濟(jì)和資源的浪費(fèi)，而且也可為安全用藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

藤黃（gamboge）為藤黃科植物藤黃（Garcinia hanburyiHook.F.）分泌的干燥樹脂，其中藤黃酸是其主要有效成分［4］。藤黃酸已被開發(fā)為一種廣譜抗腫瘤藥，對多種腫瘤有顯著療效，如對人肝癌細(xì)胞株的增殖有明顯的抑制作用，還可明顯抑制胃腺癌細(xì)胞株的增殖［3］。藤黃酸可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和抑制血管生成等多方面機(jī)制達(dá)到抗癌效果［5］?，F(xiàn)有安全性評價(jià)研究表明，藤黃酸具有腎毒性和肝毒性［6］。藤黃酸為具潛力的抗癌藥物，其心臟毒性的評價(jià)也是必要的。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在建立量化多重評價(jià)心臟毒性的指標(biāo)，并基于細(xì)胞表型綜合評價(jià)藤黃酸對心臟的毒性作用。

心臟毒性可發(fā)展為急性、亞急性和慢性疾病。臨床上急性和亞急性心臟毒性的特點(diǎn)為心室負(fù)極化的異常表現(xiàn)、QT間期延長、室上性以及室性心律失常。慢性心臟毒性表現(xiàn)為心臟無癥狀收縮和左心室舒張功能異常［7］。細(xì)胞水平的急性心臟毒性則表現(xiàn)為心肌細(xì)胞迅速死亡。但是在較溫和的環(huán)境刺激下形成的早期應(yīng)答反應(yīng)是胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，但這個(gè)過程是可逆的。心臟如受長期毒性刺激，則誘發(fā)心肌肥厚，進(jìn)而導(dǎo)致不可逆的心肌病，最終將使患者心力衰竭。心衰是心肌細(xì)胞大量死亡造成的結(jié)果，其中包括細(xì)胞凋亡和壞死。導(dǎo)致心肌死亡的分子通路有很多，包括細(xì)胞因子的活化、線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、胞內(nèi)Ca2+超載及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的活化等通路［8］。高內(nèi)涵提供了一個(gè)靈敏精確的方法檢測這些指標(biāo)在細(xì)胞表型的微弱變化。但這些變化卻不被電生理或其他傳統(tǒng)的體外方法所發(fā)現(xiàn)［9］。體內(nèi)模型雖仍然是最被廣泛認(rèn)可的檢測方法，但存在低通量，高投入的弊端，并對人體的生理反應(yīng)的預(yù)測能力有限，這導(dǎo)致動(dòng)物模型在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用減少［10-13］，而高內(nèi)涵細(xì)胞影像技術(shù)則越來越被重視和應(yīng)用［14］。例如，利用探針觀察四重?zé)晒鈽?biāo)記的細(xì)胞核、線粒體膜電位、質(zhì)膜完整性和胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，可從多參數(shù)細(xì)胞表型變化驗(yàn)證已知心肌毒性的藥物有Dox、抗霉素A、Ami、雙氯芬酸、齊多夫定和硝苯地平對CytivaTM心肌細(xì)胞的毒性影響，以及不同藥物的不同影響效果［9］。此外，以細(xì)胞活力、線粒體完整性及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成量為指標(biāo)的高內(nèi)涵檢測方法等都得到了業(yè)界的認(rèn)可和應(yīng)用［14］。因此基于以上方法我們建立了一個(gè)以H9c2，一種來源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系為模型，表現(xiàn)出骨骼肌細(xì)胞特性［15］。Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核用于測量細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核面積，MitoTracker Deep Red FM標(biāo)記線粒體表示線粒體質(zhì)量，F(xiàn)luo4 AM用來表示胞內(nèi)鈣離子含量等。Z’值代表評價(jià)方法本身的可信度，陽性對照組提供最大響應(yīng)信號，陰性對照組給出最小響應(yīng)信號，通過兩者的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差值決定了評價(jià)方法檢測信號的動(dòng)態(tài)范圍，Z’值≥0.5表示信號范圍較大，評價(jià)方法可靠［16］。本研究采用高內(nèi)涵綜合量化方法來評價(jià)藤黃酸對心肌細(xì)胞的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

H9c2心肌細(xì)胞，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶（含EDTA），美國Gibco公司；胎牛血清和青鏈霉素，美國HyClone公司；Dox和Ami，美國Sigma公司；次烏頭堿和藤黃酸，天津中醫(yī)藥中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；DMSO，中國北京索萊寶科技有限公司；熒光探針Hoechst 33342和MitoTracker Deep Red FM，美國Invitrogen公司，Rhod2 AM探針和Fluo-4 AM熒光探針，日本同仁公司。細(xì)胞培養(yǎng)瓶，96孔透底黑板和1.5 mL EP管，美國Corning公司。IL-161HI?CO2恒溫培養(yǎng)箱，中國施都凱儀器設(shè)備有限公司；Operetta高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)；美國PerkinElmer儀器有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 mg·L-1以及pH 7.2的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。隔天棄去原培養(yǎng)基，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化傳代。

1.3 樣品配置

將Dox、Ami、次烏頭堿和藤黃酸用DMSO溶解并配成10mmol·L-1的母液，樣品母液置于1.5 mL EP管中，-20℃中密封保存。細(xì)胞給藥時(shí)用DMEM高糖培養(yǎng)基逐級稀釋，4種藥物的濃度均稀釋成0.014，0.041，0.12，0.37，1.1，3.3和10 μmol·L-1。

1.4 高內(nèi)涵多指標(biāo)心臟毒性檢測方法的優(yōu)化

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔5000個(gè)細(xì)胞密度加入96孔黑色透明底的培養(yǎng)板中，每孔100 μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換入各濃度的Dox、Ami、次烏頭堿和藤黃酸100 μL每孔培養(yǎng)24 h后，熒光探針標(biāo)記細(xì)胞器：①將熒光探針Hoechst33342母液稀釋1千倍到DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；再將MitoTracker Deep Red FM母液稀釋1萬倍到含有Hoechst 33342的培基中作為“雞尾酒”染色劑；②棄去培養(yǎng)板中的培基，換成“雞尾酒”染色劑，每孔100 μL，在孵箱中避光培養(yǎng)20 min；③將Fluo-4 AM或者Rhod-2 AM母液稀釋1000倍到基礎(chǔ)培基中；④棄去培養(yǎng)板中的染色劑，換入含有Rhod-2 AM的培基，每孔50μL，避光孵育30 min；⑤將培養(yǎng)板避光取出，準(zhǔn)備進(jìn)行活細(xì)胞成像。

1.5 活細(xì)胞成像

使用High Content Screening高內(nèi)涵系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行全自動(dòng)成像。成像條件設(shè)置如下：20倍物鏡第一通道（選取激發(fā)光360～400 nm/發(fā)射光410～480 nm）Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核；第二通道（選取激發(fā)光620～640 nm/發(fā)射光650～760 nm）MitoTracker Deep Red FM標(biāo)記線粒體；第三通道（選取激發(fā)光460～490 nm/發(fā)射光500～550 nm）Fluo-4 AM或（選取激發(fā)光520～550 nm/發(fā)射光560～630 nm）Rhod-2 AM標(biāo)記胞內(nèi)鈣，每孔7個(gè)視野同時(shí)拍照。利用Columbus圖像處理及二次處理軟件對細(xì)胞表型結(jié)果進(jìn)行分析。①通過標(biāo)記細(xì)胞核，計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞數(shù)；②對細(xì)胞核形態(tài)進(jìn)行分析，檢測細(xì)胞核面積的變化；③通過計(jì)算鈣離子的探針的熒光強(qiáng)度測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量；④MitoTrack?er Deep Red染色線粒體，根據(jù)探針熒光強(qiáng)度的變化表征線粒體呼吸強(qiáng)度，統(tǒng)計(jì)為線粒體質(zhì)量；⑤檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)的變化如線粒體面積；⑥通過紋理分析方法如SER Ridge，觀察線粒體的形狀。綜合以上不同細(xì)胞器，6種指標(biāo)評價(jià)藥物對心肌細(xì)胞的毒性作用。

1.6 數(shù)據(jù)處理及二次分析

高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)結(jié)合了自動(dòng)熒光顯微鏡成像功能，可以對單次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行高通量多指標(biāo)分析。Columbus高效有序的圖像數(shù)據(jù)管理和分析系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析和管理，以及數(shù)據(jù)軟件graph pad綜合分析得到劑量-效應(yīng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，分析方法為LSD。

2 結(jié)果

2.1 胺碘酮、多柔比星、次烏頭堿和藤黃酸對細(xì)胞核的影響

2.1.1 細(xì)胞存活

抗心律失常藥Ami對心肌細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，活細(xì)胞數(shù)隨濃度的增加呈下降的趨勢，Ami約在10 μmol·L-1的濃度下對細(xì)胞有明顯的殺傷作用，其EC50值為14.83 μmol·L-1（圖1 B）；Dox對細(xì)胞有較高的致死率，使活細(xì)胞數(shù)下降，EC50值為0.72 μmol·L-1，DNA損傷使得細(xì)胞核熒光染料Hoechst 33342的熒光強(qiáng)度降低（圖1 C）；陰性對照次烏頭堿并未對H9c2心肌細(xì)胞活力造成影響（圖1 D）；藤黃酸的毒性作用則較強(qiáng)，抑制細(xì)胞存活的半數(shù)有效濃度為0.24 μmol·L-1（圖1 E）。

2.1.2 細(xì)胞核面積

細(xì)胞核面積指標(biāo)結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，Ami則使細(xì)胞核皺縮，其EC50值為6.72 μmol·L-1（圖2A）；Dox使細(xì)胞核脹大，細(xì)胞核面積在濃度1 μmol·L-1時(shí)有顯著性增加（P＜0.01），其EC50為 0.014 μmol·L-1（圖2 B）；次烏頭堿并未對細(xì)胞核造成影響（圖2 C）；而藤黃酸對細(xì)胞核有明顯的皺縮作用，使細(xì)胞核面積減小，與Ami處理組相似，EC50值為1.16 μmol·L-1（圖2 D）。

Fig.1 Effect of amiodarone（Ami，B），doxorubicin（Dox，C），hypaconitine（D）and gambogic acid（E）on nuclei of H9c2 cells by high content analysis imaging system labeling with Hoechst33342（blue）.The cells were treated with from 0.014 to 10 μmol·L-1compounds for 24 h respectively.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.2 胺碘酮、多柔比星、次烏頭堿和藤黃酸對胞內(nèi)鈣離子的影響

鈣離子染料的熒光值與正常組的熒光值做比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，Ami 10 μmol·L-1對導(dǎo)致鈣離子含量下降（圖3 A）；Dox對胞內(nèi)鈣離子含量稍微有影響，在10 μmol·L-1時(shí)有顯著性差異（P＜0.01）（圖3 B）；次烏頭堿對胞內(nèi)鈣離子無影響（圖3 C）；藤黃酸使胞內(nèi)鈣離子含量降低，EC50值為0.41 μmol·L-1（圖3 D）。

Fig.3 Effect of Ami（A），Dox（B），hypaconitine（C）and gambogic acid（D）on cellular calcium mobilization of H9c2 cell lines.H9c2 cells were exposed to compounds for 24 h at a concentration from 0.014 to 10 μmol·L-1.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3 胺碘酮、多柔比星、次烏頭堿和藤黃酸對線粒體的影響

2.3.1 線粒體質(zhì)量

圖4 B顯示，H9c2細(xì)胞受到Ami刺激后，原有的顆粒狀線粒體聚集成滴狀；線粒體的質(zhì)量降低，EC50值為4.54 μmol·L-1；Dox誘導(dǎo)線粒體失常，使線粒體形狀明顯由橢圓形變成了線形，線粒體質(zhì)量稍有增加，其EC50值為1.21 μmol·L-1（圖4 C）；次烏頭堿對細(xì)胞的線粒體未造成損傷（圖4 D）；藤黃酸作用細(xì)胞后，線粒體質(zhì)量減小，其EC50值為1.21 μmol·L-1（圖4E）。

Fig.4 Effect of Ami（A），Dox（B），hypaconitine（C）and gambogic acid（D）on the mitochondria of H9c2 cell lines by high content analysis imaging system labeling with MitoTracker Deep Red（red）.The cells were exposed to compunds at a concentration from 0.014 to 10 μmol·L-1for 24 h，respectively.n=3.＊＊P＜0.01，com?pared with control group.

2.3.2 次烏頭堿和藤黃酸對線粒體面積的影響

為了更好的說明藥物作用后線粒體的變化，增加檢測了次烏頭堿和藤黃酸作用心肌細(xì)胞后線粒體面積和線粒體紋理的變化。與正常組相比，藤黃酸不僅使線粒體質(zhì)量減小且線粒體面積有增加趨勢，其EC50值為0.44 μmol·L-1（圖5 B）次烏頭堿對細(xì)胞無任何作用（圖5 A）。

Fig.5 Effect of hypaconitine（A）and gambogic acid（B）on mitochondria area of H9c2 cell lines.H9c2 cells were exposed to compounds for 24 h at a concentration from 0.014 to 10 μmol·L-1.n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3.3 次烏頭堿和藤黃酸對線粒體紋理分析的影響

線粒體SER ridge紋理分析結(jié)果表明，與正常對照組相比，次烏頭堿作用后，SER Ridge降低（圖6 A），但藤黃酸的作用后SER Ridge降低更顯著（P＜0.01），Z’值平均為0.5，P＜0.05，假陽性率在可控范圍內(nèi)，評價(jià)方法可靠。這6種指標(biāo)都證明了藤黃酸對心肌細(xì)胞H9c2有明顯的損傷作用。

Fig.6 Effect of hypaconitine（A）and gambogic acid（B）on SER ridge of H9c2 cell lines.H9c2 cells were exposed to compounds for 24 h at a concentration from 0.014 to 10 μmol·L-1.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

3 討論

Dox是使用最廣泛的有效抗腫瘤藥物之一，但通過介導(dǎo)Bax蛋白和依賴p38造成細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，從而引起細(xì)胞凋亡［5］又促進(jìn)細(xì)胞壞死［17］，結(jié)果顯示Dox降低細(xì)胞數(shù)。本研究EC50約在0.82 μmol·L-1，與文獻(xiàn)參考值1 μmol·L-1［18］較接近。Ami屬Ⅲ類抗心律失常藥，已有研究指出Ami通過介導(dǎo)胱天蛋白酶2和胱天蛋白酶9的通路誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞凋亡［19］。最明顯的特征是細(xì)胞收縮，核固縮，染色質(zhì)凝結(jié)，細(xì)胞質(zhì)致密，細(xì)胞器分布更緊湊［20］。Ami處理導(dǎo)致細(xì)胞核收縮，線粒體聚集更緊密，EC50值已達(dá)4.50 μmol·L-1［8］。烏頭是公認(rèn)的對心臟有強(qiáng)烈毒性的中藥，其成分中包含3個(gè)主要生物堿，分別為烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿。有研究顯示，這3種單體的毒性遠(yuǎn)不及烏頭總毒性［21］，而次烏頭堿已被發(fā)現(xiàn)會(huì)造成QT間期延長［22］。本實(shí)驗(yàn)表明，與藤黃酸相比，次烏頭堿的心臟毒性較弱，僅對線粒體的分布和形狀有顯著影響，但未發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞的致死情況。

藤黃酸作為廣譜抗癌藥，對于小鼠肺癌細(xì)胞，藥物濃度為10 mg·kg-1時(shí)即有輕度療效，20 mg·kg-1已有較好抑制效果，30 mg·kg-1時(shí)可完全抑制肺癌細(xì)胞的生長［21］。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，300 nmol·L-1能有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長［23］，抑制肝癌細(xì)胞SMMC7721生長的EC50值為1.2～3.2 μmol·L-1［24-25］。小鼠后腿肌內(nèi)注射藤黃酸，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間段藥物對線粒體的損傷逐漸加重，24 h心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量增多，48 h心肌細(xì)胞線粒體腫脹，基質(zhì)變空，72 h可見畸形線粒體［26］。大鼠急性毒性試驗(yàn)和犬長期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，長期給藥會(huì)造成其肝、腎器官的明顯毒性以及心臟的部分損傷［27］。但是應(yīng)用細(xì)胞水平的檢測方法卻不多。我們發(fā)現(xiàn)藤黃酸對正常H9c2心肌細(xì)胞有明顯殺傷作用，降低細(xì)胞數(shù)EC50值相對較低（0.24μmol·L-1），對心肌細(xì)胞的毒性作用近似于Dox的結(jié)果。細(xì)胞核明顯皺縮，細(xì)胞核面積有顯著性減小，作用效果類似于胺碘酮藤黃酸1 μmol·L-1時(shí)，線粒體面積增大，其次線粒體呼吸能力有減弱傾向，＞3.3 μmol·L-1時(shí)，線粒體質(zhì)量降低。胞內(nèi)鈣離子濃度降低，說明藤黃酸作用心肌細(xì)胞，使細(xì)胞核、線粒體和胞內(nèi)鈣離子含量都產(chǎn)生了損傷。高內(nèi)涵細(xì)胞水平評價(jià)心臟毒性不僅高通量、多參數(shù)，還可預(yù)測細(xì)胞機(jī)制。

綜上，本研究建立了基于高內(nèi)涵多指標(biāo)心臟毒性安全性評價(jià)方法，并對藤黃酸的心臟毒性進(jìn)行了綜合評價(jià)及多指標(biāo)的量化分析。藤黃酸不僅促進(jìn)線粒體聚集，線粒體形狀異常，線粒體質(zhì)量下降，還導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子降低，穩(wěn)態(tài)失衡，促使心肌細(xì)胞凋亡。多重影像學(xué)參數(shù)的同步評價(jià)對藤黃酸引起的心肌細(xì)胞核及線粒體的功能和形態(tài)進(jìn)行較為全面的分析，并對其毒性作用機(jī)制做出初步的判斷，可為用藥安全性再評價(jià)及新藥開發(fā)早期毒性預(yù)測提供新的技術(shù)支持。

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Quantitative cardiotoxicity assessment of gambogic acid using multiple cellular phenotype analysis

ZHU Jie1,2,WANG Meng1,2,ZHU Yan1,2

(1.Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Tianjin International Joint Academy of Biomedicine, Tianjin 300457,China)

OBJECTIVETo evaluate the cardiotoxicity of a widen-spectrum antineoplastic drug, gambogic acid,through quantitative multiple cellular phenotypic characterization.METHODSH9c2 cell line was used as a model with doxorubicin(Dox)and amiodarone(Ami)as positive controls,hypaconi?tine as negative control and 0.1%DMSO as normal control.An optimized protocol was established to identify the morphology and function of cell nuclei.The effect of drugs on cell viability,nuclear area (Hoechst33342),mitochondria mass(MitoTracker Deep Red)and cytoplasmic calcium ion mobilization (Rhod2 AM)was studied.EC50and Z′values were calculated to evaluate the degree of toxicology and to estimate the precision and false-positive rate,respectively.RESULTSDose-response analysis indicated that EC50of Dox on cell viability,nuclear area,mitochondrial mass was 0.72,0.014 and 1.21 μmol·L-1, respectively.On the other hand,EC50of Ami on the parameters of cell viability,nuclear area and mitochon?drial mass was 14.83,6.72 and 4.54 μmol·L-1,respectively with Z′value above 0.5.Hypaconitine decreased the SER ridge of mitochondria.Gambogic acid caused significant mortality of H9c2 cells and induced nuclear shrinkage as Ami did.The EC50values of cell viability and nuclear area were 0.24 and 1.16 μmol·L-1.Meanwhile,gambogic acid disturbed the mitochondrial function as indicated by the increased mitochondrial area(EC50=0.44 μmol·L-1),abnormal SER Ridge(EC50=0.99 μmol·L-1)and decreased mitochondrial mass(EC50=1.21 μmol·L-1).Cellular calcium mobilization was lower than normal(EC50=0.41 μmol·L-1).CONCLUSIONThe EC50values of positive controls calculated from our assessment are similar those reported in literature.A multi-parameter and simultaneous evaluation enables a comprehensive analysis of the morphology of nuclei and mitochondria of cardiomyocytes and a preliminary assessment of the mechanisms of toxicity.

cardiac toxicity;gambogic acid;H9c2 cell line;high-content screening

ZHU Yan,E-mail:yanzhu.harvard@iCloud.com,Tel:15822700439

R285.1

：A

：1000-3002-（2017）01-0073-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.009

2015-12-08接受日期：2016-06-15）

（本文編輯：沈海南喬 虹）

科技部國家國際合作專項(xiàng)（2013DFA31620）；國家科技重大專項(xiàng)（2013ZX09201020）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（TD12-5031）

祝 婕，女，碩士研究生，主要從事中藥藥理研究；王 萌，女，博士，副研究員，主要從事中藥制劑及藥物安全性評價(jià)研究；朱 彥，博士，教授，主要從事中藥藥理研究。

朱 彥，E-mail：yanzhu.harvard@iCloud.com，Tel：15822700439

Foundation item:The project supported by International Cooperation Project of MOST of China(2013DFA31620);National Major New Drug Discovery(2013ZX 0920102);and Program for Tianjin Innovative Research Team in University(TD12-5031)