劉霞飛，吳 驍，楊方秀，汪玉馨，湯道權(quán)，張 玫，陸益紅

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)院藥物分析教研室，江蘇徐州 221004；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210008；3.中國(guó)藥科大學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210009）

正柴胡飲對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

劉霞飛1，2，吳 驍1，2，楊方秀1，2，汪玉馨2，3，湯道權(quán)1，張 玫2，陸益紅1，2

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)院藥物分析教研室，江蘇徐州 221004；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210008；3.中國(guó)藥科大學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210009）

目的研究正柴胡飲（ZCH）對(duì)對(duì)乙酰氨基酚（APAP）所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法將ICR小鼠隨機(jī)分為ZCH單次治療給藥組（0 h ig給予APAP，6 h ig給予ZCH）、ZCH多次治療給藥組（第1天ig給予APAP，第2天～第4天ig給予ZCH）、ZCH多次預(yù)防給藥組（前3天ig給予ZCH，第4天ig給予APAP）。單次治療給藥組、多次治療給藥組及多次預(yù)防給藥組均同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組和APAP模型組（0 h ig給予APAP），單次治療給藥組同時(shí)設(shè)ZCH單獨(dú)給藥組（0 h ig給予ZCH）。APAP的給藥量為500 mg·kg-1，ZCH的給藥量以柴胡生藥計(jì)約為36 g·kg-1。每組均在末次給藥24 h后采集血漿樣本，測(cè)定血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性，HE染色觀察肝組織病變。利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、SIMCA及SPSS16.0軟件進(jìn)行血漿代謝組學(xué)分析。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組血漿GPT和GOT酶活性均顯著升高（P＜0.01），單獨(dú)給藥組血漿GPT和GOT活性均無(wú)顯著差異；與模型組相比，單次治療給藥組、多次治療給藥組及多次預(yù)防給藥組的GPT和GOT活性顯著降低（P＜0.01），但分別與正常對(duì)照組相比仍有顯著差異（P＜0.01）。病理切片結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和單獨(dú)給藥組均未見(jiàn)明顯肝損傷。與模型組相比，單次治療給藥組肝損傷面積、多次治療給藥組肝損傷面積和多次預(yù)防給藥組肝損傷程度明顯減輕。偏最小二乘辨別分析法（PLS-DA）散點(diǎn)圖表明，單次治療給藥組、多次治療給藥組和多次預(yù)防給藥組分別遠(yuǎn)離APAP模型組，而向正常對(duì)照組方向移行。代謝譜結(jié)果表明，ZCH可調(diào)節(jié)由APAP引起的內(nèi)源性物質(zhì)變化，使其趨于正常，這些內(nèi)源性物質(zhì)涉及脂代謝、氨基酸代謝、糖代謝及能量代謝。結(jié)論ZCH對(duì)由APAP所致的藥源性肝損傷具有保護(hù)作用，代謝組學(xué)可靈敏、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)肝損傷的發(fā)生發(fā)展，為臨床合理用藥及闡明其作用機(jī)制提供依據(jù)。

正柴胡飲；對(duì)乙酰氨基酚；藥源性肝損傷；代謝組學(xué)

對(duì)乙酰氨基酚（paracetamol，acetaminophen，APAP）為乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛藥，因其對(duì)普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱及緩解多種疼痛有較好的療效而成為世界上銷量最大的非處方藥。其大劑量服用或多種含APAP的藥物聯(lián)合使用都有可能造成APAP過(guò)量引發(fā)毒性代謝產(chǎn)物大量蓄積而導(dǎo)致藥源性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡［1］。因此，尋找防治或減輕APAP所致的肝損傷的藥物已逐漸成為人們關(guān)注的主要問(wèn)題，并取得許多進(jìn)展［2-4］。

約95%APAP在經(jīng)Ⅱ相代謝與體內(nèi)的葡萄糖醛酸等結(jié)合成大分子綴合物而排毒；當(dāng)體內(nèi)蓄積了大量APAP后，部分APAP在細(xì)胞色素P450酶作用下生成毒性中間代謝產(chǎn)物N-乙?；?對(duì)苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI），少量NAPQI會(huì)和體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)谷胱甘肽結(jié)合而解毒，但當(dāng)體內(nèi)蓄積了大量毒性產(chǎn)物時(shí)，體內(nèi)谷胱甘肽耗竭，過(guò)量NAPQI和肝細(xì)胞中的大分子蛋白發(fā)生不可逆的共價(jià)結(jié)合而引起肝損傷［5］。Demirbas等［6］研究表明，口服APAP后可引起血清轉(zhuǎn)氨酶升高。近年研究發(fā)現(xiàn)，APAP的肝毒性機(jī)制和線粒體損傷及氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)［7］，有學(xué)者認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)介導(dǎo)APAP的肝損傷［8］。因此，重視APAP的肝毒性同時(shí)尋找能減輕或治療其引發(fā)的急性肝損傷的物質(zhì)成為藥學(xué)工作者關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。

柴胡（Radix Bupleuri，RB）以干燥根入藥，味辛、苦，性微寒，能解表退熱，疏肝解郁，用于感冒發(fā)熱，胸脅脹痛。含有三萜及其皂苷和揮發(fā)油等成分，有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎及抗肝損傷等功效［9］。國(guó)內(nèi)曾有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，用四氯化碳、乙醇及APAP制備小鼠肝損傷模型或肝癌模型，RB水提液或醇提液對(duì)肝起到明顯的保護(hù)作用，并可降低肝癌的發(fā)生率和死亡率，但機(jī)制不明確［10-14］。

“正柴胡飲（Zheng Chaihu Yin，ZCH）”為明代名醫(yī)張景岳著《景岳全書》中的解表平散代表方，由RB、陳皮、防風(fēng)、赤芍藥、生姜和甘草所組成，具有發(fā)散風(fēng)寒，解熱止痛的功效，主治外感風(fēng)寒初起、惡寒發(fā)熱、無(wú)汗、頭痛、鼻塞、噴嚏、咽癢咳嗽和四肢酸痛等證［15］。當(dāng)外感風(fēng)寒發(fā)熱時(shí)，臨床常見(jiàn)含APAP的解熱鎮(zhèn)痛藥與ZCH等中成藥合用。盡管上述文獻(xiàn)報(bào)道了RB可減輕APAP引發(fā)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝損傷，但其作用機(jī)制尚不明確。這種中西藥配伍是否合理？當(dāng)過(guò)量使用含APAP的解熱鎮(zhèn)痛藥時(shí)RB能否起到保肝作用？其作用機(jī)制是什么？這些都是亟待解決的問(wèn)題，中醫(yī)藥防治作用是綜合的、整體的和動(dòng)態(tài)的，因此有必要引入整體化及系統(tǒng)化的研究方法對(duì)ZCH肝保護(hù)作用進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后發(fā)展起來(lái)的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的一個(gè)重要分支，是研究細(xì)胞、組織或器官在受到外界微小擾動(dòng)后體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，通過(guò)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)受到外界擾動(dòng)前后的差異來(lái)發(fā)現(xiàn)和疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。它彌補(bǔ)了基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的不足，即基因在體內(nèi)不一定全部得到表達(dá)，而蛋白質(zhì)在體內(nèi)也不一定存在活性，基因及蛋白質(zhì)的變化最終都會(huì)影響到體內(nèi)的小分子內(nèi)源性物質(zhì)，通過(guò)給藥前后分析體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，可為疾病發(fā)生機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)［16］。近年來(lái)，基于液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用、核磁等代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，代謝組學(xué)已成為探尋中、西藥相互作用機(jī)制及毒性生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的重要方法，通過(guò)有監(jiān)督或無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別方法為疾病潛在生物標(biāo)志物的發(fā)掘提供了嶄新而可靠的手段，為疾病的預(yù)防、早期診斷及治療提供有效的參考依據(jù)。Sun等［17］采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析大鼠經(jīng)胃APAP后尿液中和毒性相關(guān)的代謝產(chǎn)物并尋找到和氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程相關(guān)的生物標(biāo)志物。

綜上所述，本課題擬采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)研究APAP肝損傷過(guò)程中，ZCH單次、多次治療給藥及多次預(yù)防給藥后ICR小鼠代謝組學(xué)上的變化，揭示與肝損傷相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)的種類與程度，從而探明ZCH解毒和保肝的可能作用靶點(diǎn)。為中藥的藥效作用整體評(píng)價(jià)以及中西藥合用的合理性提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥物和儀器

HPLC級(jí)甲酸購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，HPLC級(jí)乙腈購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，超純水由本實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Mil-ford，MA，USA）制得。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transami?nase，GPT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）試劑盒購(gòu)自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司。ZCH水提液的制備：按照10∶10∶8∶4∶15∶7的比例稱取RB（產(chǎn)地：甘肅）、陳皮（產(chǎn)地：浙江）、防風(fēng)（產(chǎn)地：河北）、甘草（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）、赤芍（產(chǎn)地：安徽）和生姜（產(chǎn)地：山東）生藥飲片適量，浸泡30 min，首次加10倍水煎煮1.5 h，第二次加8.5倍水煎煮1.5 h，將所得藥汁水提醇沉24 h后，減壓濃縮至密度為1.25～1.30，含RB生藥3.8 kg·L-1。上述水提液由精華藥業(yè)有限公司提供（批號(hào)為20140305），收率為0.3%。APAP（化學(xué)純，含量≥98%）由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。實(shí)驗(yàn)時(shí)以0.5%羧甲纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）制成均勻混懸液。甜菜堿、肌酸和18種氨基酸等對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，肉毒堿和溶血磷脂膽堿等對(duì)照品由美國(guó)Sigma公司提供。

Agilent 1290超高效液相色譜儀（ultra-perfor?mance liquid chromatography，UPLC）（美國(guó)安捷倫公司），Bruker Maxis Impact quadrupole-time-offlight mass spectrometry（Q-TOF-MS）（德國(guó)布魯克公司），SIEMENS Dimension Xpand plus全自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)西門子公司），湘儀L-550臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘潭離心機(jī)有限公司），Beckman Coulter Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司），METTLER TOLEDO十萬(wàn)分之一及百萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），自動(dòng)渦旋混合器ZH-2（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠），Thermo真空離心濃縮揮干儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.2 動(dòng)物、分組和處理

ICR小鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004，動(dòng)物飼養(yǎng)于江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院屏障系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0042，飼養(yǎng)溫度：20℃～26℃；相對(duì)濕度：40%～70%，明暗10/14 h，自由通風(fēng)。給藥前禁食12 h，自由飲水。將ICR小鼠隨機(jī)分為單次治療給藥組（0 h ig給予APAP，6 h ig給予ZCH）、多次治療給藥組（第1天ig給予APAP，第2天～第4天ig給予ZCH）、多次預(yù)防給藥組（ig給予ZCH 3 d，第4天ig給予APAP）。單次治療給藥組、多次治療給藥組和多次預(yù)防給藥組均同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組和APAP模型組（0 h ig給予APAP），單次治療給藥組同時(shí)設(shè)ZCH單獨(dú)給藥組（0 h ig給予ZCH）。各組每組10只小鼠。APAP的給藥量為500 mg·kg-1，ZCH給藥量以RB生藥計(jì)約為36 g·kg-1。各給藥組均于末次給藥24 h后于小鼠右眼內(nèi)眥靜脈取血，置于EDTA抗凝管中，3000×g離心10 min，取上清。取肝，用預(yù)冷生理鹽水洗凈吸干，稱重，并肉眼觀察肝大體變化。

1.3 生化指標(biāo)測(cè)定及HE染色觀察肝組織病理變化

全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿中GPT和GOT活性，每組隨機(jī)選取5只動(dòng)物肝于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)病理切片，HE染色，鏡像觀察肝臟組織病理變化。

1.4 代謝組樣品制備

實(shí)驗(yàn)前，取上述血漿樣品低溫解凍，各取100 μL解凍后的樣本，加入400 μL含0.1%甲酸的甲醇-乙腈溶液（體積1∶1），渦旋3 min，4℃20 000×g離心10 min，取上清液300 μL經(jīng)真空離心濃縮揮干儀吹干后用150 μL含0.1%甲酸的甲醇-乙腈溶液（體積1∶1）復(fù)溶，渦旋3 min，4℃20 000×g離心10 min，取上清液100 μL進(jìn)樣。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀：色譜柱為XBridgeTMAmide（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，Waters）；流速：0.2 mL·min-1；柱溫35℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序?yàn)?%～35%A 0～14 min；35%～60% A 14～17 min；60%～98%A 17～22 min；98%A 22～25 min；98%～2%A 25～27 min；2%A 27～30 min。進(jìn)樣量：5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），參數(shù)設(shè)置如下：干燥氣溫度及流量：180℃，6 L·min-1。毛細(xì)管電壓：正離子模式：3800 V，負(fù)離子模式：3500 V。數(shù)據(jù)采集范圍m/z50～1000，Scan模式進(jìn)行正負(fù)離子全掃描。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Bruker Profile Analysis軟件進(jìn)行峰查找及峰校正，設(shè)置質(zhì)荷比范圍m/z50～1000，質(zhì)量偏差10 mu，設(shè)置修正50%缺失值，即通過(guò)50%共有峰尋找內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，在95%置信區(qū)間下，最終得到滿足上述條件的保留時(shí)間、質(zhì)荷比及峰強(qiáng)度的三維數(shù)據(jù)。應(yīng)用SIMCA-P16.0多變量分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選擇偏最小二乘辨別分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）得到散點(diǎn)分布圖（scores plot）及荷載圖（loadings plot），選擇變量重要程度（variable importance in the projection，VIP）≥1的變量結(jié)合t檢驗(yàn)（P＜0.05）及二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果與HMDB及METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，尋找出潛在生物標(biāo)志物。用SPSS16.0軟件采用單因素方差分析進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05，P＜0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZCH水提液指紋圖譜及主要成分鑒定

圖1A為ZCH水提液正離子模式下的總離子流圖，5種主要活性成分的一級(jí)質(zhì)譜圖（圖1B～F），通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖比對(duì)，它們分別為RB皂苷a，b1，b2，c和d。

2.2 ZCH對(duì)APAP所致急性肝損傷小鼠血漿GPT和GOT活性的影響

2.2.1 單次治療給藥

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組血漿中GPT和GOT活性顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明APAP 500 mg·kg-1能明顯引起小鼠肝急性損傷。與正常對(duì)照組相比，單獨(dú)給藥組血漿中GPT及GOT活性無(wú)明顯變化，說(shuō)明ZCH水提液36 g·kg-1不會(huì)引起小鼠肝損傷。與模型組相比，單次治療給藥組血漿中GPT和GOT活性均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明ZCH水提液?jiǎn)未沃委熌苊黠@緩解APAP引起的急性肝損傷。

2.2.2 多次治療給藥

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組血漿中GPT和GOT含量顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明APAP 500 mg·kg-1能明顯引起小鼠肝急性損傷。與模型組相比，多次治療組血漿中GPT和GOT含量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明ZCH水提液多次治療能緩解由APAP引起的肝毒性。

2.2.3 多次預(yù)防給藥

表3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組血漿中GPT和GOT含量顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明APAP 500 mg·kg-1能明顯引起小鼠肝急性損傷。與模型組相比，多次預(yù)防給藥組血漿中GPT和GOT含量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明ZCH水提液預(yù)防給藥可減輕APAP所致肝損傷。

Fig.1 Total ion chromatogram（TIC）fingerprints（A）of water extract of Zheng Chaihu Yin（ZCH）in positive ion mode and mass spectra of saikoside a（B），saikoside b1（C），saikoside b2（D），saikoside c（E）and saikoside d（F）.

Tab.1 Effect of ZCH single treatment on plasma GPT and GOT of male ICR mice administered with APAP

Tab.2 Effects of ZCH multiple treatment on plasma GPT and GOT of male ICR mice administered with APAP

2.3 ZCH對(duì)APAP所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

2.3.1 單次治療

HE染色發(fā)現(xiàn)（圖2），正常對(duì)照組及單獨(dú)給藥組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈索狀排列，肝細(xì)胞胞核正常，胞漿貯積較多的糖原，肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯的變性、壞死，肝竇無(wú)擴(kuò)張充血，間充質(zhì)未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)纖維組織增生。模型組肝結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉界限不清，主要發(fā)生于小葉中心，壞死肝細(xì)胞大部分呈溶解狀，有的壞死處見(jiàn)較多出血，偶見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，單次給藥組盡管存在部分肝細(xì)胞灶性壞死，呈濃縮狀，呈溶解狀，或肝細(xì)胞見(jiàn)空泡變性，病變處偶見(jiàn)出血，但肝細(xì)胞病變程度有明顯的減輕。不同組間的肝損傷面積表明，ZCH單次給藥和APAP合用能減輕APAP所致的肝細(xì)胞病變，對(duì)APAP引起的肝毒性具有保護(hù)作用。

Tab.3 Effect of ZCH mulitiple pretreatment on plasma GPT and GOT of male ICR mice when administered 3 d prior-dosing with APAP

Fig.2 Effect of ZCH single treatment on liver pathology histology of male ICR mice administered with APAP. See Tab.1 for the treatment.The black arrow shows the necrotic hepatocyte.

2.3.2 多次治療

HE染色發(fā)現(xiàn)（圖3），在ZCH多次預(yù)防給藥實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組與模型組結(jié)果與圖2中一致。與模型組相比，多次治療給藥組存在肝細(xì)胞灶性壞死，部分呈濃縮狀，呈溶解狀，有的肝細(xì)胞見(jiàn)空泡變性，但病變程度明顯減輕。各組間肝損傷面積結(jié)果表明，ZCH多次和APAP治療給藥組緩解了APAP引起的肝細(xì)胞病變程度。

Fig.3 Effect of ZCH mulitple treatment on liver patho?histology of male ICR mice administered APAP.See Tab.2 for the treatment.The black arrow shows the necrotic hepatocyte.

2.3.3 多次預(yù)防

HE染色發(fā)現(xiàn)（圖4），正常對(duì)照組與模型組結(jié)果與圖2中一致。與模型組相比，多次預(yù)防給藥組存在肝細(xì)胞灶性壞死，部分呈濃縮狀，呈溶解狀，或肝細(xì)胞見(jiàn)空泡變性，但病變程度明顯減輕。各組間肝損傷面積分析表明，ZCH多次預(yù)防給藥能減輕APAP引起的肝細(xì)胞病變。

2.4 ZCH對(duì)APAP所致急性肝損傷小鼠血漿代謝組的影響

2.4.1 單次治療

采用正離子模式對(duì)3組血漿樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，均得到UPLC-Q-TOF色譜圖（圖5）。

Fig.4 Effect of ZCH multiple pretretament on liver pathohistology of male ICR mice administered with 3 d prior-dosing to APAP.See Tab.3 for the treatment.The black arrow shows the necrotic hepatocyte.

采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)血漿樣品進(jìn)行分析，原始數(shù)據(jù)通過(guò)Bruker Profile Analysis軟件共找到900多個(gè)共有峰，將這些內(nèi)源性物質(zhì)的豐度信息導(dǎo)入SIMCA-P軟件中作PLS-DA分析。從PLS-DA分析的散點(diǎn)圖（圖6A，R2X=0.616，R2Y=0.988，Q2=0.966）可見(jiàn)，模型，正常對(duì)照及單次治療給藥3組之間呈現(xiàn)良好的區(qū)分，單次治療給藥組與模型組之間存在一定的距離，說(shuō)明肝損傷程度較模型組輕。提示ZCH能改善APAP引起的與肝毒性相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)變化，減輕由APAP引起的肝損傷，結(jié)果與臨床生化指標(biāo)及組織病理學(xué)結(jié)果一致。PLS-DA分析的載荷圖（圖6B）提示離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)可能是潛在生物標(biāo)志物。通過(guò)色譜峰強(qiáng)度可見(jiàn)，模型組與正常對(duì)照組相比、單次治療給藥組與正常對(duì)照組相比及單次治療給藥組與模型組相比，棕櫚酰組氨酸、棕櫚酰肉毒堿、十七酰肉毒堿、硬脂酰肉毒堿、鞘氨醇、磷酸絲氨酸〔phos?phatidylserine，PS（40∶1）〕、膽堿、磷脂酰乙醇胺〔phosphatidyl ethanolamine，PE（19∶1）〕、溶血卵磷脂〔Lysophosphatidylcholine，LPC（14∶0）〕、1-磷酸葡萄糖及精氨酸的變化有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）（圖7）。

Fig.5 Effect of ZCH single treatment on plasma metabo?lomics total ion chromatorgraphys（TIC）profiles of male ICR mice by ultra-performance liquid chromatography/ quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOFMS）in positive mode.See Tab.1 for the treatment.

Fig.6PLS-DA score plots（A）and loadings plots（B）by UPLC-Q-TOF-MS in positive mode of ZCH single treatment on plasma metabolomics of male ICR mice.See Tab.1 for the treatment.

Fig.7Changes in chromatographic peak intensity of endogenous substances related to lipid metabolism，amino acid metabolism and energy metabolism in mouse plasma.See Tab.1 for the treatment.n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.4.2 多次治療

采用正離子模式對(duì)3組血漿樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，均得到UPLC-Q-TOF色譜圖（圖8）。

PLS-DA分析的散點(diǎn)圖（圖9A，R2X=0.739，R2Y= 0.915，Q2=0.556）可見(jiàn)，模型組獨(dú)立分布在第三象限，正常對(duì)照和多次治療給藥組之間有一定的重合區(qū)域，表明多次治療給藥組已向正常對(duì)照組趨近，有減輕APAP肝損傷的趨勢(shì)。PLS-DA分析的載荷圖（圖9B）提示離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)可能是潛在生物標(biāo)志物。通過(guò)色譜峰強(qiáng)度可見(jiàn)，模型組與正常對(duì)照組相比、多次治療給藥組與正常對(duì)照組相比及多次治療給藥組與模型組相比，PC和PE及脯氨酸的變化有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）（圖10）。

2.4.3 多次預(yù)防

采用正離子模式對(duì)3組血漿樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，均得到UPLC-Q-TOF色譜圖（圖11）。

從PLS-DA分析的散點(diǎn)圖（圖12A，R2X=0.658，R2Y=0.984，Q2=0.961）可見(jiàn)，模型、正常對(duì)照及多次預(yù)防給藥組呈現(xiàn)了良好的區(qū)分度。PLS-DA分析的載荷圖（圖12B）提示離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)可能是潛在生物標(biāo)志物。通過(guò)色譜峰強(qiáng)度可見(jiàn)，模型組與正常對(duì)照組相比、多次預(yù)防給藥組與正常對(duì)照組相比及多次預(yù)防給藥組與模型組相比，植物鞘氨醇、乙酰膽堿、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、PE、肌酸、丙氨酸、1-磷酸葡萄糖及甘油磷酰膽堿的變化有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）（圖13）。

Fig.8 Effect of ZCH multiple treatment on plasma metabolomics TIC profiles of male ICR mice plasma by UPLC-Q-TOF-MS in positive ion mode.See Tab.2 for the treatment.

Fig.9 PLS-DA score plots（A）and loadings plots（B）of ZCH multiple treatment on plasma metabolomics of male ICR mice by UPLC-Q-TOF-MS in positive mode.See Tab.2 for the treatment.

Fig.10Changes in chromatographic peak intensity of endogenous substances related to lipid metabo?lism，amino acid metabolism and energy metabolism in mouse plasma.See Tab.2 for the treatment.n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Fig.11Effect of ZCH multiple pretreatmnet on plasma metabolomics TIC profiles of male ICR mice by UPLC-QTOF-MS in positive ion mode.See Tab.3 for the treatment.

Fig.12 PLS-DA score plot（A）and loadings plot（B）of ZCH multiple pretreatment on plasma of male ICR mice by UPLC-Q-TOF-MS in positive mode.See Tab.3 for treatment.

Fig.13 Changes in chromatographic peak intensity of endogenous substances related to lipid metabolism，amino acid metabolism and energy metabolism in mouse plasma.See Tab.3 for the treatment.x±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

ZCH單次及多次與APAP聯(lián)合用藥，從血漿GPT及GOT水平和肝組織病理學(xué)變化可見(jiàn)有明顯保護(hù)APAP肝損傷的作用，通過(guò)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和研究，從體內(nèi)近千個(gè)內(nèi)源性代謝物的分析也可發(fā)現(xiàn)ZCH有改善APAP所致肝損傷的趨勢(shì)。血漿代謝組學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZCH的保肝作用涉及改善脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝及能量代謝過(guò)程。在3種給藥方式中，單次治療給藥組、多次預(yù)防給藥組與正常對(duì)照組有顯著差異的標(biāo)志物數(shù)量相當(dāng)，但種類有所不同，多次治療給藥組改善數(shù)量最少。相同種類的化合物均涉及PC和PE，ZCH單次與APAP聯(lián)合用藥對(duì)肉毒堿類化合物的改善更為顯著。

在脂質(zhì)代謝通路中，APAP模型組中多種PC水平升高表明線粒體膜的損傷及磷脂膽堿體內(nèi)代謝過(guò)程的紊亂，PC峰強(qiáng)度增大與肝壞死及GPT和GOT活性的升高有密切的關(guān)系，這與文獻(xiàn)［8］報(bào)道相符。肝細(xì)胞的磷脂酶模型組被APAP激活而水解成PC，PC的蓄積使肝細(xì)胞膜溶解，細(xì)胞膜溶解后因其通透性增加而引發(fā)轉(zhuǎn)氨酶入血，最終引起GPT和GOT的升高。涉及脂肪酸β-氧化過(guò)程中的十七酰肉毒堿、棕櫚酰肉毒堿及硬脂酰肉毒堿在APAP模型組中的含量明顯高于正常對(duì)照組。McGill等［18］研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量服用APAP后，肉毒堿含量上調(diào)，與本研究結(jié)果一致。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，在肝損傷過(guò)程中肉毒堿含量下降［19］，推測(cè)可能是因?yàn)槿舛緣A類物質(zhì)在體內(nèi)的平衡狀態(tài)處于一定的范圍，其含量過(guò)高或過(guò)低都極易打破其平衡，導(dǎo)致肝疾病的發(fā)生。

在氨基酸代謝環(huán)節(jié)中，APAP模型組棕櫚酰組氨酸含量升高，可能是因?yàn)榻M氨酸是谷氨酸合成的前體物質(zhì)，谷氨酸可通過(guò)氧化脫氨作用生成α-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)，ZCH通過(guò)下調(diào)棕櫚酰組氨酸的含量維持TCA循環(huán)的穩(wěn)態(tài)而發(fā)揮作用。丙氨酸在體內(nèi)經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)礁危ㄟ^(guò)聯(lián)合脫氨作用釋放出氨來(lái)合成尿素，這是肝細(xì)胞的一種重要的生物學(xué)功能，由于APAP模型組丙氨酸含量升高，導(dǎo)致肝內(nèi)合成尿素受阻，從而引發(fā)肝損傷。

1-磷酸葡萄糖是肝細(xì)胞線粒體糖酵解過(guò)程中的重要原料，肝糖原在糖原磷酸化酶的作用下生成1-磷酸葡萄糖，1-磷酸葡萄糖進(jìn)而在磷酸葡萄糖變位酶的作用下生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖最終經(jīng)一系列反應(yīng)生成丙酮酸完成整個(gè)糖酵解過(guò)程［20］。ZCH通過(guò)上調(diào)1-磷酸葡萄糖的含量恢復(fù)肝細(xì)胞線粒體的功能狀態(tài)，使糖酵解過(guò)程得到恢復(fù)，進(jìn)而減輕肝毒性。

給藥組中的膽堿及乙酰膽堿含量與APAP模型組比較呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)。乙酰膽堿作為體內(nèi)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，能特異性地作用于膽堿受體。郭燕等［21］采用Wistar大鼠誘導(dǎo)肝纖維化模型，研究和絡(luò)舒肝膠囊對(duì)模型組肝乙酰膽堿受體的影響探討其抗肝纖維化的機(jī)制，通過(guò)聚合酶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn)模型組中乙酰膽堿的含量明顯高于正常對(duì)照組，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，其機(jī)制可能與其促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)［22］。膽堿是合成乙酰膽堿的前體，乙酰膽堿可在膽堿酯酶的作用下水解成膽堿，體內(nèi)模型組乙酰膽堿含量的升高導(dǎo)致了模型組膽堿的含量升高。

本研究表明，代謝組學(xué)技術(shù)手段與血生化指標(biāo)及病理切片分析方法相比有明顯的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)血漿樣本代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與肝損傷相關(guān)的生物標(biāo)志物，可從整體上闡明ZCH對(duì)藥源性肝損傷的保護(hù)機(jī)制，可能為探索藥物在體內(nèi)相互作用靶點(diǎn)提供一條新的研究途徑。

致謝：感謝本院譚力老師對(duì)本研究的指導(dǎo)，感謝江蘇省安評(píng)中心白文霞老師對(duì)本研究提供的幫助。

［1］Larrey D.Epidemiology and individual susceptibility to adverse drug reactions affecting the liver［J］. Semin Liver Dis，2002，22（2）：145-155.

［2］James LP，Mayeux PR，Hinson JA.Acetamino?phen-induced hepatotoxicity［J］.Drug Metab Dispos，2003，31（12）：1499-1506.

［3］Kaplowitz N.Acetaminophen hepatoxicity：what do we know，what don′t we know，and what do we do next？［J］.Hepatology，2004，40（1）：23-26.

［4］Muldrew KL，James LP，Coop L，Mccullough SS，Hendrickson HP，Hinson JA，et al.Determination of acetaminophen-protein adducts in mouse liver and serum and human serum after hepatotoxic doses ofacetaminophen using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］. Drug Metab Dispos，2002，30（4）：446-451.

［5］Mcgill MR，Williams CD，Xie Y，Ramachandran A，Jaeschke H.Acetaminophen-induced liver injury in rats and mice：comparison of protein adducts，mitochondrial dysfunction，and oxidative stress in the mechanism of toxicity［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2012，264（3）：387-394.

［6］Demirbas S，Cakir E，Akgul EO，Seyrek M，Cayci T，Kurt YG，et al.Elevated serum neopterin levels in acetaminophen-induced liverinjury［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2011，31（1）：165-170.

［7］Mcgill MR，Sharpe MR，Williams CD，Taha M，Curry SC，Jaeschke H.The mechanism underlying acetaminophen-induced hepatotoxicity in humans and mice involves mitochondrial damage and nuclear DNA fragmentation［J］.J Clin Invest，2012，122（4）：1574-1583.

［8］Chang EE，Chang YC，Liang CH，Huang CP，Chiang PC.Identifying the rejection mechanism for nanofiltration membranes fouled by humic acid and calcium ions exemplified by acetaminophen，sulfamethoxazole，and triclosan［J］.J Hazard Mater，2012，221-222：19-27.

［9］Niu XR.Overview pharmacological effects of Bupleurum［J］.ChinaPharm（中國(guó)藥師），2009，12（9）：1310-1312.

［10］Wei H，Wei WG，Liu Q，Meng JG，Wang D. Experimental study of hepatoprotective effect of qinling bupleurum extraction［J］.Shaanxi J Tradit Chin Med（陜西中醫(yī)），2012，33（10）：1432-1433.

［11］Hu XJ，Liu XQ.Effects of Xiaochaihu decoction on damage of gut-liver-brain in CCl4/ethanol induced mouse hepatocellular carcinoma［J］.Chin J Exp Tradit Med Form（中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志），2012，18（23）：207-212.

［12］Wang SC，Wang L，Tian WB，Zhao HP.Effects of Chaihu and Wulingwan on chronic liver lesion in mice［J］.J Fourth Mil Med Univ（第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)），2002，23（2）：133-136.

［13］ Shi H，Xie DH.Protecting effect of water extraction portion of herba bupleurl and bupleurum Chinese on mice with acute hepatic injury［J］.J Nanjing Univ Tradit Chin Med（南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)），2009，25（6）：461-462.

［14］Wang ZY，Nan JX.Protective effect of bupleurum Chinese againstacute liverinjuryinduced by acetaminophen（AAP）in mice［J］.China Pharm（中國(guó)藥師），2008，11（7）：747-749.

［15］Fu HY，Yan MZ，Lu CA，He XZ，Zhou AX，Tian JL，et al.Pharmacological studies of Zhengchaihuyin［J］.China J Chin Mater Med（中國(guó)中藥雜志），1986，11（5）：303-307.

［16］Wu X，Lu YH，Wang YX，Tang DQ，F(xiàn)an XL. Research advances in drug-induced liver injury based on systems biology technology［J］.Chin Pharm J（中國(guó)藥學(xué)雜志），2014，49（12）：1009-1013.

［17］Sun J，Schnackenberg LK，Beger RD.Studies of acetaminophen and metabolites in urine and their correlations with toxicity using metabolomics［J］. Drug Metab Lett，2009，3（3）：130-136.

［18］Mcgill MR， Li F，Sharpe MR， Williams CD，Curry SC，Ma X，et al.Circulating acylcarnitines as biomarkers of mitochondrial dysfunction after acet?aminophen overdose in mice and humans［J］. Arch Toxicol，2014，88（2）：391-401.

［19］Jiao LL，Yang WS，Lin XH，Yang RF，Xu GB. Plasma total carnitine and free carnitine level in healthy adults and patients with liver diseases［J］. Lab Med（檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)），2007，22（5）：528-530.

［20］Wang JY，Zhu SG，Xu CF.Biochemistry（生物化學(xué)）［M］.3rd ed.Beijing：Higher Education Press，2002：1-11.

［21］Guo Y，Gao X，Yan W，Zhang FW，Tang WX. Effect of heluoshugan capsules on acetylcholine re?ceptor in liver tissue fibrosis［J］.Chin J Histochem Cytochem（中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志），2007，16（2）：154-158.

［22］ Yang HH，Tang CL.Effect of cholinergic pathway for inflammation of the liver［J］.Int J Digest Dis（國(guó)際消化病雜志），2014，34（3）：179-181.

Protective effect of Zheng Chaihu Yin on paracetamol induced acute liver injury of mice

LIU Xia-fei1，2，WU Xiao1，2，YANG Fang-xiu1，2，WANG Yu-xin2，3，TANG Dao-quan1，ZHANG Mei2，LU Yi-hong1，2

（1.Department of Pharmacautical Analysis，Xu zhou Medical Vniversity，Xuzhou 221004，China；2.Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210008，China；3.China Pharmaceutical University，Nanjing 210008，China）

OBJECTIVETo explore the effect of aqueous extract ofZheng Chaihu Yin（ZCH）on paracetamol（acetaminophen，APAP）-induced hepatotoxicity.METHODSMale ICR mice were dividedinto three scenarios randomly：the single treatment dose of ZCH，multiple treatment or pretreatment dose of ZCH.Each scenario had a up control group and an APAP model group，while single treatment dose of ZCH group had a ZCH group at the same time.The dose of APAP and ZCH was 500 mg·kg-1and 36 g·kg-1，respectively.24 h after the last administration，plasma and liver samples were prepared.Ultra-performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS）based metabolomics profiling was used to examine changes in plasma after expo?sure to ZCH，APAP or co-exposure to ZCH and APAP.Glutamic pyruvic transaminase（GPT）and glutamic oxaloacetic transaminas（GOT）values were determined by a biochemical auto analyzer in plasma.Histopathologic changes in the liver were observed and the area was calculated after HE staining. The data were analyzed with SPSS16.0 statistical software and the results were compared with the test between the two groups to find biomarkers.Also，SIMCA software was used for partial least squares-discriminant analysis（PLS-DA）pattern recognition.RESULTSCompared to control group，APAP dosing alone caused an increase in plasma transaminases and alterations in multiple metabolic pathways.Compared to APAP group，decrease in plasma transaminases was noted when ZCH was administered after or prior to APAP.Histopathologic results showed that in the single treatment group，multiple treatment group and pretreatment group，ZCH could alleviate the liver damage induced by APAP from（32.3±12.0）%to（14.2±9.9）%，（8.6±7.9）%to（5.2±1.7）%and（32.5±10.0）%to（5.2±6.4）%（P＜0.05）.Similarly，the PLS-DA of the LC-MS data showed that the groups dosed with APAP alone were the most distinct from controls，while animals dosed with ZCH prior to or after APAP treatment were located near control group.Metabolic spectrum results showed that ZCH could restore the changes in endogenous substances including lipid metabolism，amino acid metabolism，sugar metabolism and energy metabolism induced by APAP to normal.CONCLUSIONZCH water-extraction plays major roles in the regulation of metabolism on APAP-induced liver injury.These studies demonstrate that UPLCQ-TOF-MS-based metabolomic analysis can be sensitively and accurately predict the initiation and progres?sion of liver injury and greatly contribute to a better understanding of the hepatoprotective effects of ZCH in a clinical environment.

Zheng Chaihu Yin；paracetamol；drug-induced liver injury；metabolomics

LU Yi-hong，E-mail：yihonglu@163.com，Tel：（025）86633622

R285

A

1000-3002-（2017）01-0101-11

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.013

2016-01-05接受日期：2016-09-05）

（本文編輯：沈海南 賀云霞）

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（20152X09303001）

劉霞飛，女，碩士，主要從事體內(nèi)藥物分析及藥品安全性研究；陸益紅，女，博士，主任藥師，主要從事藥物分析及藥品安全性評(píng)價(jià)。

陸益紅，E-mail：yihonglu@163.com，Tel：（025）86633622

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project of China（20152X09303001）