陳轉(zhuǎn)艮+丁少波+梁淑貞+陳潤添

【摘要】 目的 研究采用多波長高效液相色譜法測定杜仲3類有效成分的效果。方法 采用Dionex C18柱以及流動相組成一種甲醇-0.1%磷酸水來進行梯度洗脫操作， 對杜仲中的3類有效成分進行測定， 分析測定結(jié)果。結(jié)果 進行色譜峰分離的效果較好， 多波長高效液相色譜法能夠?qū)Χ胖僦械奶胰~珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸以及京尼平苷酸進行同時測定， 其中桃葉珊瑚苷的含量為0.67%， 松脂醇二葡萄糖苷的含量為0.45%， 綠原酸的含量為3.16%， 京尼平苷酸的含量為1.12%。結(jié)論 多波長高效液相色譜法測定杜仲3類有效成分的效果顯著， 操作簡單， 具有較好的重現(xiàn)性， 能夠為杜仲內(nèi)在質(zhì)量的控制提供科學有效的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 多波長高效液相色譜法；杜仲；有效成分

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.01.096

杜仲屬于一種名貴的中藥材， 具有利尿、安胎、堅筋骨以及降血壓等諸多功效[1]。該藥物的主要化學成分包括杜仲膠、多糖、黃酮、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類以及木脂素類等。部分學者對杜仲中的桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷以及京尼平苷酸等進行了測定， 這4種物質(zhì)屬于杜仲的主要藥效成分， 可以將其概括為3大類， 在測定上具有較大的難度[2-6]。本研究主要探討多波長高效液相色譜法測定杜仲3類有效成分的效果， 總結(jié)如下。

1 儀器與試劑

1. 1 儀器 超聲波清洗器（頻率為25 kHz， 功率為250 W）；FZ102型微型植物試樣粉碎機；precisa 分析天平；UltiMate 高效液相色譜儀。

1. 2 試劑 二次蒸餾水；甲醇（色譜純）；杜仲皮（產(chǎn)地：山東）；京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸對照品。

2 方法

2. 1 制備供試品溶液 稱取50 g杜仲藥材， 將其研制成為絮狀粉末， 取2 g左右的樣品粉末， 將其放置在具塞錐形瓶中， 將60 ml 75%的甲醇加入， 對其進行稱重， 進行30 min的超聲提取， 冷置， 對其進行稱重， 將減失的重量補足， 然后再將其濾過， 藥渣再重復(fù)上述操作一次。進行兩次濾液處理之后將其減壓濃縮， 并且采用相同濃度的甲醇溶液對其進行定容， 一直到20 ml， 對其進行均勻搖晃， 采用0.45 μm的微孔濾膜對其進行濾過， 最后獲得供試品溶液。

2. 2 制備對照品溶液 稱取適量的京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸對照品， 將其放置在容量瓶中（10 ml）， 將色譜純甲醇加入到其中， 將其溶解， 并將其稀釋到刻度， 對其進行搖晃， 將其制備成為對照品混合儲備液， 具體的濃度：桃葉珊瑚苷為0.70 g/L、松脂醇二葡萄糖苷為0.50 g/L、綠原酸為3.32 g/L、京尼平苷酸為1.20 g/L， 采用冷藏的方式進行保存。

2. 3 色譜具體條件 進樣量為10 μl；檢測波長分別為320、280、240、210 nm；柱溫為25℃；流速為1.0 ml/min；流動相為甲醇-0.1% 磷酸水梯度洗脫；色譜柱為 Dionex C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）。

3 結(jié)果與分析

3. 1 優(yōu)化提取條件 提取方法采用回流法與超聲法， 根據(jù)已經(jīng)擬定好的色譜條件， 分別采用兩種提取方式對提取的樣品進行測定， 將4種有效成分的峰面積之和作為考察的具體指標， 結(jié)果顯示出兩種提取方法不具備較大的差異性， 但是超聲提取這種方式具有快捷、簡單等優(yōu)點， 所以最終選用超聲提取法對樣品進行提取。

3. 2 優(yōu)化超聲提取條件 稱取2 g杜仲藥品， 一共有9份， 對超聲提取杜仲中主要活性成分提取時間、提取次數(shù)、料液比以及溶解濃度等影響因素進行 L9（34）正交試驗[7-10]， 結(jié)果顯示最好的提取方案為：料液比1 g/30 ml、75%甲醇、進行3次超聲提取， 將每次提取的時間控制在30 min。其次， 結(jié)果顯示料液比對杜仲中主要成分的提取影響最大， 其次為提取次數(shù)、甲醇濃度、反應(yīng)時間。

3. 3 優(yōu)化色譜條件 檢測波長的選擇：對樣品采用PDA-3000光電二極管進行全波長掃描， 為了能夠達到干擾小、吸收強的目的， 對京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸各物質(zhì)的光譜性質(zhì)差異進行利用， 將3D-plot圖譜作為依據(jù)， 最終決定采用四波長進行檢測[11-13]， 具體為：320 nm測定綠原酸、280 nm測定松脂醇二葡萄苷、240 nm測定京尼平苷酸、210 nm測定桃葉珊瑚苷。在這種條件下， 能夠獲得最多的圖譜信息量， 并且具有較好的峰形， 基線平穩(wěn)， 溶劑受到的干擾少， 能夠?qū)Ω鞣N物質(zhì)進行準確的分析。

優(yōu)化流動相：對甲醇-乙腈、乙腈-水、甲醇-水分別進行梯度洗脫比較， 結(jié)果顯示， 在甲醇-水位流動相時， 分離較好， 出峰較多， 但是會有拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)， 所以將磷酸快加入到流動相中， 以此來達到消除拖尾的目的。結(jié)果顯示， 甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脫時， 能夠獲得理想的色譜峰分離度以及峰形， 具有較好的程序穩(wěn)定性。

3. 4 方法學考證 線性關(guān)系考察：采用流動相溶液將對照品儲備液稀釋， 并且配備成為對照品系列溶液， 桃葉珊瑚苷：0.08、0.17、0.35、0.70、1.40 g/L；松脂醇二葡萄糖苷：0.06、0.12、0.25、0.50、1.0 g/L；綠原酸：0.42、0.83、1.66、3.32、6.64 g/L；京尼平苷酸：0.15、0.30、0.60、1.20、2.40 g/L。分別進樣5 μl， 對其進行55次平行測定， 結(jié)果顯示， 京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸的峰面積和其進樣濃度具有良好的線性關(guān)系。

方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性以及回收率分析：選取相同批次的5份供試品， 采用供試品溶液制備以及檢測方法對其進行測定， 對其重復(fù)性的RSD進行計算， 結(jié)果顯示， 在24 h內(nèi)， 試品溶液具有較好的穩(wěn)定性， 并且實驗的重復(fù)性好。

3. 5 杜仲樣品測定 取約2 g的杜仲樣品粉末， 對其進行精密稱定， 放置在具塞錐形瓶中， 采用優(yōu)化后的提取方案提取樣品， 并且在最優(yōu)色譜條件下對其進行測定， 結(jié)果分別在320、280、240、210 nm的波長條件下進行檢測， 最終結(jié)果顯示， 桃葉珊瑚苷的含量為0.67%， 松脂醇二葡萄糖苷為0.45%， 綠原酸為3.16%， 京尼平苷酸為1.12%。這種波長能夠?qū)Ω鞣N化合物的含量進行準確的測定。

4 討論

本研究采用多波長高效液相色譜法對杜仲3類有效成分進行測定， 可以在相同的色譜條件下采用不同波長對其進行檢測， 能夠有效實現(xiàn)同時定量測定多個成分、多類組分的目的， 不僅在很大程度上提高了檢測效率， 而且其精密度與準確度能夠與要求相符合。與此同時， 進行方法學考察、色譜條件優(yōu)化以及提取條件優(yōu)化之后， 對提取條件進行了最終確定[14， 15]。最后， 實驗對樣品中4種成分的含量采用多波長同時檢測的方式進行了測定， 具有較高的可靠性與精確性。

綜上所述， 多波長高效液相色譜法測定杜仲3類有效成分的效果顯著， 操作簡單， 具有較好的重現(xiàn)性， 能夠為杜仲內(nèi)在質(zhì)量的控制提供科學有效的依據(jù)。

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