李京京，尤煥煥，王 丹，趙永峰，王 斌

研究植物乳桿菌對(duì)腸道細(xì)菌易位的抑制作用

李京京1，尤煥煥1，王 丹1，趙永峰1，王 斌2

目的 研究植物乳桿菌對(duì)腸道細(xì)菌易位的抑制作用。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)對(duì)照組，乳桿菌L2灌胃組，缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)組，乳桿菌預(yù)處理+缺血再灌注組。觀察各組動(dòng)物腸黏膜形態(tài)病理學(xué)變化、腸道菌群變化、細(xì)菌易位、血漿細(xì)胞因子的水平。結(jié)果 與假手術(shù)對(duì)照組相比，缺血再灌注組大鼠腸黏膜有明顯病理損傷改變，腸黏膜出現(xiàn)壞死、脫落。腸道內(nèi)厭氧菌數(shù)量顯著下降，腸桿菌數(shù)量也有所下降。在肝、脾、腎及腸系膜淋巴結(jié)中有細(xì)菌存在，其易位率達(dá)87.5%(P<0.01)。乳桿菌灌胃組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，乳桿菌預(yù)處理+I/R組其變化程度較之缺血再灌注組顯著減弱。結(jié)論 植物乳桿菌L2能夠抑制腸道缺血再灌注損傷引起的細(xì)菌易位，減弱其對(duì)腸黏膜屏障的損傷。

植物乳桿菌；抑制；腸道；缺血再灌注；細(xì)菌易位

細(xì)菌易位是指原存在于腸腔中的細(xì)菌或內(nèi)毒素，通過某種途徑穿過腸黏膜屏障，進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)、門靜脈系統(tǒng)，繼而進(jìn)入體循環(huán)以及肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)器官的過程[1]。隨著對(duì)全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的深入研究，發(fā)現(xiàn)危重患者中的感染，絕大多數(shù)是由腸源性微生物引起的，因此，腸源性感染細(xì)菌易位被認(rèn)為是引發(fā)SIRS和MODS的主要原因[2-4]。大量的臨床研究表明，腸道缺血再灌注(I/R)損傷可以誘發(fā)腸黏膜屏障受損和細(xì)菌易位。腸道I/R損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，各種創(chuàng)傷、大出血、心源性或感染性休克發(fā)生時(shí)，機(jī)體為保護(hù)心、腦等重要臟器，血液重新分布，腸黏膜及黏膜下層血流減少，缺血而使組織內(nèi)含氧量降低，血管通透性增加，組織間隙滲出液增多，形成組織水腫，黏膜上皮緊密連接受損。血流再灌注后引發(fā)的炎性反應(yīng)進(jìn)一步造成大量炎性反應(yīng)細(xì)胞的組織浸潤以及炎性介質(zhì)的釋放，最終導(dǎo)致腸黏膜壞死，通透性增高，細(xì)菌通過腸黏膜屏障，形成腸道細(xì)菌易位[5-7]。

乳桿菌是人體腸道內(nèi)重要的生理有益菌，它具有維持胃腸道內(nèi)穩(wěn)，抑制病原菌的入侵和感染及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。但是乳桿菌的益生特性具有菌株特異性，不同菌株之間其功能差異很大。本課題組前期篩選了一株益生性能較好的植物乳桿菌L2，為了進(jìn)一步了解該菌株對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用，本研究擬通過建立腸道I/R模型誘發(fā)腸道細(xì)菌易位，觀察植物乳桿菌L2對(duì)腸道細(xì)菌易位的抑制作用，以期為闡明乳桿菌保護(hù)腸黏膜屏障的可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 植物乳桿菌L2(Lactobacillus plantarum)分離自人的腸道，由本室保存。將菌株接種于新鮮配制的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。SD大鼠，32只，雌性，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重180～200 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠32只，隨機(jī)分為以下4組，每組8只。假手術(shù)對(duì)照組；乳桿菌灌胃組(每日灌胃植物乳桿菌L2 2 ml/次/d，菌液濃度為4×1010CFU/ml，連續(xù)灌胃14 d)；缺血再灌注模型組；乳桿菌預(yù)處理+缺血再灌注組(術(shù)前每日灌胃植物乳桿菌L2 2 ml/次/d，菌液濃度為4×1010CFU/ml，連續(xù)灌胃14 d，后進(jìn)行缺血再灌注手術(shù))。

1.3 缺血再灌注模型 將SD大鼠麻醉(氯胺酮腹腔注射，2 mg/kg)。沿腹白線切開，暴露腹腔。無菌游離腸系膜上動(dòng)脈，用血管夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈，30 min后松開血管夾，使血流再灌注。后關(guān)腹，4 h后處死動(dòng)物，收集標(biāo)本。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 細(xì)菌易位檢測 無菌取腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎1 g，將其置于滅菌的玻璃勻漿器中，加入生理鹽水5 ml，進(jìn)行組織勻漿，后取勻漿液100 μl，分別接種于血平板和BHI培養(yǎng)基，將血平板置于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，BHI平板置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。

1.4.2 腸道菌群分析 無菌采集新鮮盲腸內(nèi)容物0.5～1.0 g，確定重量后，將樣品置于加有稀釋液的無菌三角瓶中，充分震蕩20 min后，混勻后系列稀釋，分別接種選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)。腸桿菌、腸球菌分別接種于EMB瓊脂和EC瓊脂，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。乳桿菌接種于MRS，雙歧桿菌接種于改良的BS瓊脂，擬桿菌接種于BBE瓊脂，分別置于37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。待菌落長出后，以菌落形態(tài)，革蘭染色，生化反應(yīng)等進(jìn)行細(xì)菌鑒定，計(jì)算每克盲腸內(nèi)容物中的細(xì)菌數(shù)量。

1.4.3 血漿細(xì)胞因子的檢測 無菌抽取下腔靜脈血2 ml，置于肝素抗凝管中，3000 rpm離心20 min，吸取上層血漿，置于-80 ℃冰箱中，統(tǒng)一檢測。采用ELISA法檢測TNF-α和IL-6，按其說明書進(jìn)行。

1.4.4 形態(tài)病理學(xué)觀察 無菌行剖腹術(shù)，距回盲部以上4 cm處，取回腸組織2～4 cm，用PBS緩沖液輕微沖洗后，置10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌易位分析 結(jié)果顯示，I/R組與假手術(shù)對(duì)照組相比，在其腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)器官中均發(fā)現(xiàn)了大量的細(xì)菌，其易位率為87.5%(P<0.01)。乳桿菌L2灌胃組，在其腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)器官中并未檢出細(xì)菌。而乳桿菌L2+I/R組中，分別有兩只動(dòng)物在其腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中檢出細(xì)菌，但數(shù)量明顯要少于I/R組，其易位率為25%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與I/R組相比，其細(xì)菌易位率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1、2)。

表1 各組大鼠腸道細(xì)菌易位的分析結(jié)果 (n=8)

注：與假手術(shù)對(duì)照組比較，①P<0.01；與I/R模型組比較，②P<0.01

2.2 腸道菌群 腸道菌群計(jì)數(shù)結(jié)果顯示， I/R組與假手術(shù)對(duì)照組相比，厭氧的革蘭陽性乳桿菌、雙歧桿菌，以及革蘭陰性擬桿菌數(shù)量顯著下降(P<0.01)，革蘭陰性腸桿菌數(shù)量也有所下降(P<0.05)，而腸球菌數(shù)量卻無明顯變化。乳桿菌L2灌胃組中，厭氧菌和兼性厭氧菌的數(shù)量與假手術(shù)對(duì)照組相比無顯著變化。乳桿菌L2預(yù)處理+I/R組中，厭氧的擬桿菌、雙歧桿菌，以及乳桿菌的數(shù)量與假手術(shù)對(duì)照組相比，無顯著變化，但腸桿菌的數(shù)量有所上升(P<0.05)。與I/R組相比，其擬桿菌、雙歧桿菌以及乳桿菌的數(shù)量顯著增高(P<0.05，表3)。

表2 各組大鼠組織器官細(xì)菌易位檢測結(jié)果 (n=8)

注：與假手術(shù)對(duì)照組相比，①P<0.01；與I/R模型組相比，②P<0.01

表3 各組動(dòng)物盲腸內(nèi)容物腸道菌群分析結(jié)果 (log10 CFU/g；n=8)

注：與假手術(shù)對(duì)照組比較，①P<0.05；與I/R模型組比較，②P<0.05

2.3 血漿細(xì)胞因子濃度的變化 采用ELISA法分別檢測了各組大鼠血漿中TNF-α 和 IL-6的濃度(圖1)，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠血漿TNF-α水平顯著增加(P<0.01)，IL-6水平略有增加，但無顯著性差異。乳桿菌L2灌胃組中，其TNF-α和IL-6水平與假手術(shù)對(duì)照組相比，無顯著性差異。而在乳桿菌L2預(yù)處理+I/R組中，其TNF-α水平與假手術(shù)對(duì)照組相比略有降低，但無顯著性差異。但與I/R組相比，其TNF-α水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其IL-6水平與假手術(shù)對(duì)照組和I/R組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 形態(tài)病理學(xué)觀察 光鏡觀察結(jié)果顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，I/R組大鼠在缺血再灌注后4 h，其腸黏膜水腫、萎縮，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。腸黏膜發(fā)生壞死、脫落，腸絨毛排列紊亂、稀疏，上皮細(xì)胞脫落；乳桿菌L2灌胃組大鼠腸黏膜完整，腸絨毛排列整齊，未見上皮細(xì)胞脫落；乳桿菌L2預(yù)處理+I/R組大鼠腸黏膜病變明顯減輕，腸黏膜及絨毛高度明顯增加，絨毛輕度水腫，僅見少量炎性細(xì)胞浸潤，絨毛排列較為整齊、致密，未見上皮細(xì)胞脫落(圖2)。

圖1 各組大鼠血漿細(xì)胞因子檢測結(jié)果

圖2 大鼠腸黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察(HE，×200)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在腸道缺血30 min，再灌注后4 h(I-30 min/R-4 h)，腸黏膜已發(fā)生嚴(yán)重壞死、脫落，大量細(xì)菌易位至腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)器官中，其易位率達(dá)87.5%。腸黏膜上皮細(xì)胞對(duì)缺氧極為敏感，既便是很短時(shí)間的缺血、缺氧，都可造成腸上皮細(xì)胞的損傷。血流再灌注后，誘發(fā)大量的炎性細(xì)胞因子和活性氧自由基，進(jìn)一步加重了對(duì)腸黏膜屏障的損傷，誘使腸腔中的細(xì)菌穿過腸黏膜進(jìn)入體循環(huán)。后者一旦大量進(jìn)入血液，就會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致多種炎性介質(zhì)的過度釋放，引發(fā)或加重過度炎性反應(yīng)，形成一種惡性循環(huán)[8-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷4 h后，血漿中炎性細(xì)胞因子TNF-α水平顯著增加，并且從腸黏膜形態(tài)病理學(xué)觀察中也發(fā)現(xiàn)，存在有大量的炎性細(xì)胞浸潤，這與以往的報(bào)道相符[12，13]，表明炎性反應(yīng)是造成腸黏膜屏障損傷的一個(gè)重要因素。

植物乳桿菌L2是本課題組從人體腸道中分離的一株益生菌，前期大量的實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)其具有優(yōu)良的益生特性。在本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性給予植物乳桿菌L2，可有效地抑制腸道I/R損傷引起的細(xì)菌易位，并且減弱I/R造成的腸黏膜損傷。以往的研究顯示，乳酸菌對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用大多通過調(diào)節(jié)菌群失調(diào)、維護(hù)腸道微生態(tài)平衡等。在本研究中，腸道菌群分析結(jié)果顯示，植物乳桿菌L2能夠有效地促進(jìn)有益的厭氧菌的生長，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，這可能是它保護(hù)腸黏膜屏障的方式之一。另外，值得注意是，植物乳桿菌L2能夠明顯降低I/R損傷時(shí)血漿中炎性細(xì)胞因子TNF-α的水平，本研究的前期研究結(jié)果顯示，植物乳桿菌L2能夠抑制外周血單核細(xì)胞釋放TNF-α[14]，這與本研究的前期體外研究結(jié)果相符。

綜上所述，表明植物乳桿菌L2具有抑制過度炎性反應(yīng)，參與調(diào)控腸道內(nèi)穩(wěn)的作用。對(duì)于I/R造成的腸黏膜損傷，與大量使用抗生素所致的腸黏膜損傷不同，I/R可引起較為嚴(yán)重的機(jī)械屏障損傷，致使腸腔中大量的細(xì)菌發(fā)生易位。因此，該菌株還可能具有維護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障的作用。對(duì)于植物乳桿菌抑制I/R引起的細(xì)菌易位的分子機(jī)制，有待于進(jìn)一步進(jìn)行深入的研究。

[1] Steinberg S M. Bacterial translocation: what it is and what it is not[J]. Am J Surg, 2003, 186 (3): 301-305.

[2] Shimizu K, Ogura H, Goto M,etal. Altered gut flora and environment in patients with severe SIRS[J]. J Trauma, 2006, 60 (1):126-133.

[3] Gatt M, Reddy B S, MacFie J. Bacterial translocation in the critically ill-evidence and methods of prevention[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2007, 25 (7): 741-757.

[4] Reddy B S, MacFie J, Gatt M,etal. Commensal bacteria do translocate across the intestinal barrier in surgical patients[J]. Clin Nutr, 2007, 26 (2): 208-215.

[5] Yüksek Y N, Kologlu M, Daglar G,etal. Intestinal ischemia-reperfusion injury augments intestinal mucosal injury and bacterial translocation in jaundiced rats[J]. Hepatogastroenterology, 2004, 51 (55): 171-175.

[6] Matthijsen R A, Derikx J P, Kuipers D,etal. Enterocyte shedding and epithelial lining repair following ischemia of the human small intestine attenuate inflammation[J]. PLoS One, 2009, 4 (9): e7045.

[7] Amaral F A, Fagundes C T, Guabiraba R,etal. The role of macrophage migration inhibitory factor in the cascade of events leading to reperfusion-induced inflammatory injury and lethality[J]. Am J Pathol, 2007, 171 (6):1887-1893.

[8] Souza D G, Amaral F A, Fagundes C T,etal. The long pentraxin PTX3 is crucial for tissue inflammation after intestinal ischemia and reperfusion in mice[J]. Am J Pathol, 2009, 174 (4): 1309-1318.

[9] Stefanutti G, Pierro A, Parkinson EJ,etal. Moderate hypothermia as a rescue therapy against intestinal ischemia and reperfusion injury in the rat[J]. Crit Care Med, 2008, 36 (5):1564-1572.

[10] Stefanutti G, Pierro A, Vinardi S,etal. Moderate hypothermia protects against systemic oxidative stress in a rat model of intestinal ischemia and reperfusion injury[J]. Shock, 2005, 24 (2):159-164.

[11] Leaphart C L, Tepas J J.The gut is a motor of organ system dysfunction [J]. Surgery，2007，141(5):563-569.

[12] Fagundes C T, Amaral F A, Souza A L,etal. ST2, an IL-1R family member, attenuates inflammation and lethality after intestinal ischemia and reperfusion[J]. J Leukoc Biol, 2007, 81 (2): 492-499.

[13] Tadros T, Traber D L, Heggers J P,etal. Effects of interleukin-1alpha administration on intestinal ischemia and reperfusion injury, mucosal permeability, and bacterial translocation in burn and sepsis[J]. Ann Surg, 2003, 237 (1): 101-109.

[14] Wang Bin, Li Jieshou, Li Qiurong,etal. Isolation of adhesive strains and evaluation of the colonization and immune response by Lactobacillus plantarum L2 in the rat gastrointestinal tract [J]. Int J Food Microbiol, 2009, 132 (1): 59-66.

(2016-09-17收稿 2016-12-30修回)

(責(zé)任編輯 張 楠)

Lactobacillusplantarumprevents bacterial translocation induced by intestinal ischemia and reperfusion injury in rats

LI Jingjing1, YOU Huanhuan1, WANG Dan1，ZHAO Yongfeng1，and WANG Bin2.

1.Department of Ultrasonic Sound, Nanjing Hospital of Armed Police Force, Nanjing 210008,China; 2.Jiangsu Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Nanjing 210001,China

Objective To investigate the ability ofLactobacillusplantarumL2 to prevent intestinal ischemia and reperfusion induced bacterial translocation.Methods 32 SD rats were randomly divided into four groups: sham, Lactobacillus intragastric administration, ischemia and reperfusion (I/R) model, Lactobacillus pre-treatment and I/R model. The bacterial translocation, changes of gut microflora, levels of proinflammatory cytokines in plasma and intestinal morphology were observed.Results The increase in bacterial translocation was significant after 4 h I/R treatment (P<0.01) as compared with sham-operated group. There were obvious pathological changes of mucosal morphology in I/R rats and the number of anaerobic bacteria such as Bifidobacteria, Lactobacillus and Bacteroides was significantly reduced. The level of TNF-α in plasma was increased after I/R injury.Lactobacillusplantarumtreatment alone had no effect on intestinal barrier function. However, pretreatment of rats withLactobacillusplantarumL2 significantly abrogated I/R induced intestinal mucosal injury and prevented translocation of bacteria to mesenteric lymph nodes or to remote organs.ConclusionsLactobacillusplantarumL2 has the ability to prevent bacterial translocation and attenuate I/R induced intestinal injury.

Lactobacillusplantarum；prevent；gut；ischemia and reperfusion；bacterial translocation

江蘇省自然科學(xué)基金(BK20141518)

李京京，碩士研究生，主治醫(yī)師。

1.210008 南京，武警江蘇總隊(duì)南京醫(yī)院影像科；

2.210001 南京，江蘇省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院

王 斌，E-mail: wangbin301@sohu.com

R378.2