曹留霞，武澗松，徐曉丹，賀 丹

EGCG對A549細胞炎性反應模型UBC9表達的影響

曹留霞，武澗松，徐曉丹，賀 丹

目的 觀察泛素連接酶9(ubiquitin conjugating enzyme 9，UBC9)在表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)作用的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導A549細胞中的表達，探討UBC9與EGCG抗炎性反應機制的相關性。方法 根據篩選結果隨機分為對照組、EGCG組、LPS組、EGCG+LPS組4個組,MTT檢測不同濃度的EGCG(50～400 μg/ml)和LPS(10～50 μg/ml)對A549細胞增殖活性的影響，篩選最佳作用濃度，進一步通過免疫組化染色法、蛋白質印跡法和Realtime-PCR檢測分析各處理組UBC9蛋白及其mRNA的相對表達量。結果 MTT顯示，200 μg/ml的EGCG細胞增殖抑制作用最強(F=1618.18，P<0.001)，LPS 25μg/ml細胞增殖活性最明顯(F=237.38，P<0.001)。免疫組化與蛋白質印跡檢測均顯示，與對照組比較，EGCG下調A549細胞UBC9蛋白表達(P<0.001)，LPS則上調UBC9表達量(P<0.001)，與LPS組比較，EGCG+LPS組UBC9蛋白表達明顯降低(P<0.001)。同樣，Realtime-PCR顯示，與對照組比較，EGCG組UBC9 mRNA表達下調(F=89.34，P<0.001)，LPS組UBC9 mRNA表達上調(F=225.00，P<0.001)，與LPS組比較，EGCG+LPS組UBC9 mRNA的表達受到抑制，顯著降低(F=625.00，P<0.001)。結論 EGCG下調LPS刺激的炎性反應模型的UBC9的表達，其抗炎機制可能與抑制UBC9蛋白與mRNA表達有關。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；脂多糖；泛素連接酶9；炎性反應

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶提取物茶多酚的主要活性成分。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是細菌內毒素的主要成分，可刺激組織細胞增生，激發(fā)多種炎性物質釋放，誘導炎性反應的發(fā)生。泛素連接酶9(ubiquitin conjugating enzyme 9，UBC9) 作為類泛素化修飾中的關鍵酶，在腫瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用[1],已有研究發(fā)現UBC9在人類多種腫瘤中呈高表達[2,3]，如乳腺癌、頭頸部腫瘤、肺癌。炎性反應是導致癌癥發(fā)生發(fā)展的重要因素，被認為是癌癥的第七特征[4,5]。有研究報道，EGCG對肺癌[6]、肝癌[7]、鼻咽癌[8]、宮頸癌[9]等腫瘤細胞均有抑制作用，但EGCG抗癌效應是否與抗炎有關以及具體機制的研究目前尚未見報道。本研究通過探討EGCG對LPS誘導的人肺腺癌上皮細胞株A549細胞炎性反應模型的作用及是否與調節(jié)UBC9蛋白與mRNA的表達量有關，旨在為臨床癌癥診療提供新的生物指標。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌上皮細胞株A549由青島大學附屬醫(yī)院中心實驗室提供，1640培養(yǎng)液及胎牛血清為Hyclone公司產品，大腸桿菌LPS、EGCG購自Sigma公司，羊抗人UBC9多克隆抗體購自Sata公司，PV-9000二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京博奧森，RNA抽提試劑盒、Realtime-PCR試劑盒、cDNA合成試劑盒及SYBR Master Mixture均購自大連Takara公司。引物序列均由上海生工技術有限公司合成，其中用于Realtime-PCR的引物具體序列(表1)。

表1 Realtime-PCR引物序列

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 人肺腺癌上皮細胞株A549復蘇后培養(yǎng)于含胎牛血清的10%DMEM-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、擴增，擴增3～4代后用于實驗，取指數生長期細胞稀釋為7×103個細胞接種于96孔板，隨機分組。

1.2.2 細胞活性測定實驗 根據前期實驗篩選的濃度進行實驗，加入不同濃度的EGCG(50～400 μg/ml)和LPS(10～50 μg/ml)，對照組加入相應體積的無血清DMEM-1640培養(yǎng)液，每組設6個平行孔。然后，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后取出96孔板，PBS沖洗3次，加入MTT后繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后傾去上清液，加二甲基亞砜溶解，振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光度值(A值)，篩選EGCG、LPS最佳濃度，以用于下步實驗。細胞存活率(%)=(實驗組A490-空白組A490)/(對照組A490-空白組A490)×100%。

1.2.3 免疫組化法實驗 根據篩選結果作用于預先多聚賴氨酸包被的爬片，實驗分為對照組、EGCE組、LPS組和EGCG+LPS組4個組，作用24 h后取出細胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定，PBS沖洗3次，0.1% TritonX-100室溫孵育15 min,沖洗3次，3%過氧化氫37 ℃孵育10 min,稀釋一抗UBC9(1∶50)4 ℃過夜，生物素標記的二抗(1∶100)依次37 ℃孵育30 min和150 min，PBS充分沖洗，染色、復染、脫水、封片。以細胞內呈現黃色或棕褐色顆粒為陽性反應，隨機計數200個細胞，Image-pro Plus軟件分析陽性信號強度。

1.2.4 蛋白印跡法檢測實驗 加入不同實驗因素，作用24 h后收集各組的A549細胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取樣本蛋白，BAC法定量蛋白，制備SDS-PAGE膠，常規(guī)電泳，轉膜，封閉，一抗(NF-κB 1∶500，iNOS 1∶200，UBC9 1∶1000)孵育4 ℃過夜，二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，顯色劑(1∶1)顯色，Lane1D凝膠分析軟件分析，設未處理的細胞作為對照組，以GAPDH作為內參。

1.2.5 細胞UBC9 mRNA相對表達量測定 Trizol法提取總RNA，取1 μl的反應體系分光光度計測定RNA純度(OD260/280介于1.8～2.0)。采用Takara反轉錄試劑盒反轉錄,根據總RNA濃度計算體積，參照Takara說明書擴增，目的基因與內參都是95 ℃預變性30 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共35個循環(huán)。制定標準曲線，根據標準曲線公式計算樣本的拷貝數。

2 結 果

2.1 MTT檢測結果 不同濃度的EGCG(50～400 μg/ml)作用于A549細胞24h后，均顯示了對A549細胞增殖活性的抑制，組間兩兩比較進一步顯示200 μg/ml濃度的EGCG抑制細胞增殖活性作用更強(F=1618.18，P<0.001，圖1A)。各濃度組LPS(10～50 μg/ml)則均可促進細胞的增殖活性，其中25 μg/ml濃度LPS的增殖促進作用最為明顯(F=237.38，P<0.001，圖1B)。以25 μg/ml為LPS刺激濃度，200 μg/ml為EGCG干預濃度。

圖1 不同濃度的EGCG、LPS對對A549細胞增殖

2.2 細胞UBC9蛋白表達測定結果

2.2.1 免疫組化法 染色與蛋白信號強度檢測顯示，與對照組(圖2A)比較，EGCG使細胞變圓，細胞質皺縮，胞核固縮，UBC9蛋白表達下調(圖2B，F=1022.42，P<0.001)，LPS則促進細胞增殖，可見細胞數量增多、細胞質與核著色加深，蛋白表達上調(圖2 C，F=717.89，P<0.001)。與LPS組比較，加入EGCG的干預組細胞數量明顯減少，細胞變小變園，胞質萎縮，胞核固縮，UBC9蛋白表達量顯著下降(圖2D，F=664.31，P<0.001)。其中，UBC9蛋白在各組細胞細胞核、細胞質的表達量與對比關系見圖3。

2.2.2 蛋白印跡法 以GAPDH為標準對照，印跡帶初步顯示了UBC9蛋白在各個實驗組的表達情況，LPS上調UBC9蛋白在A549細胞中的表達水平，EGCG下調A549細胞及LPS誘導的A549細胞中UBC9蛋白的表達量(圖4)。蛋白定量軟件灰度值分析顯示(圖5)，與對照組比較，LPS、EGCG分別上調、下調UBC9蛋白在A549細胞中的表達(F1=7150.26，F2=6079.35，P<0.001)，EGCG顯示了對LPS刺激的A549細胞的調節(jié)作用，與LPS組比較，EGCG干預下調LPS誘導的A549細胞的UBC9蛋白表達量(F=1270.26，P<0.001)。

圖2 各組A549細胞免疫組化染色(×400)

圖3 各組A549細胞胞核胞質BUC9的表達量

①與對照組比較P<0.01；②與LPS組比較P<0.01

2.3 細胞UBC9 mRNA相對表達量測定結果 Realtime-PCR檢測與蛋白測定結果一致(圖6)，與對照組比較，LPS刺激組UBC9 mRNA相對表達量上調(F=225.00，P<0.001)，EGCG組呈現下調趨勢(F=89.34，P<0.001)。與LPS組比較，EGCG干預下調LPS誘導的A549細胞UBC9 mRNA的相對表達量(F=625.00，P<0.001)。

圖4 各組A549細胞UBC9蛋白免疫印跡帶

圖5 各組A549細胞BUC9蛋白表達量的灰度測定

圖6 各組A549細胞BUC9 mRNA的相對表達量

3 討 論

肺癌作為最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，生存率低，預后不良，是一種嚴重威脅人類健康的惡性疾病。研究表明，炎性反應與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后都有密切的關系，是肺癌發(fā)生發(fā)展的重要驅動因素，探討抗炎機制，尋找早期診斷標志物對深化肺癌發(fā)病機制的認識、指導臨床診治和評價預后具有重要意義[10,11]。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是一種強烈的炎性反應誘導劑。茶多酚是從綠茶中提取出來的多酚類化合物，EGCG為茶多酚的主要組成成分，亦是其最重要的活性成分，多項研究報道了EGCG的抗腫瘤效應[12，13]。文獻[14，15]發(fā)現，EGCG能夠明顯抑制LPS誘導的炎性反應過程。近年來，炎癌分子機制的研究已成為癌變研究領域關注的焦點，類泛素化修飾(SUMO化修飾)是一種蛋白質翻譯后修飾，在細胞周期調控、轉錄調控、核質轉運、蛋白質相互作用、DNA修復及維持基因組穩(wěn)定性等方面扮演重要角色[16],其過程中的重要因子在許多腫瘤組織中表達異常[17]，被認為可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵分子機制。UBC9作為類泛素化修飾中的關鍵酶，廣泛地表達于人類諸多器官和組織，介導細胞功能調節(jié)與實現，已有研究發(fā)現UBC9在包括肺癌在內的多種腫瘤中呈現高表達[17，18]。

本研究通過觀察EGCG、LPS作用的人肺腺癌上皮A549細胞及EGCG作用的LPS刺激A549細胞中UBC9蛋白與mRNA的表達量，探討EGCG對LPS刺激的A549細胞炎性反應模型的調節(jié)作用及其機制是否與調節(jié)UBC9蛋白與mRNA的表達量有關。本研究MTT顯示，不同實驗濃度的EGCG均能夠抑制A549細胞的增殖活性，而不同實驗濃度的LPS則都能夠促進A549細胞的增殖，其中200 μg/ml的EGCG抑制效應最明顯，25 μg/ml的LPS促進效應最顯著，為最佳作用濃度。進一步的免疫組化學染色顯示，EGCG作用的A549細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞體積變小，胞質濃縮，核固縮，部分染色質呈現高度濃縮，脫落、聚集于核中央部的致密核，可呈花瓣狀或環(huán)狀；而LPS作用的A549細胞，細胞密度增大，細胞體積變大，細胞質、細胞核染色變深，加入EGCG干預后細胞數量明顯減少，細胞變小變園，胞質萎縮，胞核固縮。量化分析顯示，UBC9蛋白表達與Realtime-PCR檢測結果一致，LPS上調A549細胞UBC9蛋白與 mRNA的表達，EGCG則下調UBC9蛋白與mRNA的表達(P<0.01)，EGCG對LPS刺激的A549細胞炎性反應模型的UBC9蛋白與mRNA表達有抑制作用(P<0.01)。LPS誘導炎性反應，促進細胞增殖的作用機制涉及到受體識別、信號轉導、蛋白修飾、因子釋放等過程，本研究發(fā)現LPS誘導的A549細胞炎性增殖模型中UBC9蛋白及其mRNA表達量顯著增加，提示UBC9可能是肺癌細胞增殖的重要活性分子。EGCG可抑制LPS刺激的A549細胞的增殖活性，本研究結果與文獻[14,15]報道一致。同時，本研究證實LPS刺激的A549細胞施予EGCG干預后，增殖抑制的同時，UBC9蛋白與mRNA表達明顯下調，進一步表明UBC9可能在癌細胞炎性反應增殖過程中扮演重要角色，且構成EGCG調節(jié)干預的關鍵靶點。由此，初步推測EGCG對LPS誘導的A549細胞炎性反應的抑制，作用可能與調節(jié)UBC9蛋白及其mRNA表達有關。這一研究發(fā)現為通過抗炎機制防治肺癌的研究拓展了新的思路和線索，通過更深入的探討，檢測和干預UBC9有望成為肺癌臨床診療的新的指征和策略。

綜上所述，由于本研究缺乏封閉或過表達UBC9的數據，EGCG抗炎機制與抑制UBC9間的邏輯聯系尚不充分，這種相關性推測外延的拓展需要開展進一步的實證研究，克服細胞體外實驗自身的局限性，基于標準的炎性反應動物模型，系統觀察EGCG對UBC9表達和癌細胞在體轉歸的影響，特別是對慢性低劑量炎-癌模型UBC9變化及其癌癥轉歸相關性觀察，從而夯實研究結論可靠性和科學性的數據基礎。

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(2016-09-05收稿 2016-11-15修回)

(責任編輯 郭 青)

Effect of EGCG on UBC9 expression in inflammatory model of A549 cells

CAO Liuxia, WU Jiansong, XU Xiaodan, and HE Dan.

Department of Infectious Diseases, General Hospital of the PLA Rocket Force, Beijing 100088, China

Objective To observe the effect of EGCG on the expression of UBC9 in the A549 inflammatory model, and investigate its correlation with the anti-inflammatory mechanism of EGCG.Methods A549 cells were randomly divided in vitro into four group: control group, EGCG group, LPS group, and EGCG plus LPS group. The proliferative activity of A549 cells, which were incubated with different concentrations of EGCG(50～400 μg/ml) and LPS(10 ～50 μg/ml), was detected by MTT method to select the optimum concentration for experiment. The relative expressions of UBC9 protein and mRNA in each group were determined with immunohistochemical staining, Western blot and real-time-PCR, and compared.Results MTT showed that 200 μg/ml EGCG had the strongest inhibitory effect on proliferation of A549 cells(F=16181.18,P<0.001), while 25 μg/ml LPS had the strongest promoting effect (F=237.38,P<0.001). As observed with immunohistochemistry and Western blot, EGCG down-regulated the expression of UBC9 protein(P<0.001) while LPS up-regulated the expression(P<0.001) compared to control group. Compared to LPS group, the expression of UBC9 protein in EGCG plus LPS group was reduced significantly(P<0.001). Similarly, Real-time-PCR revealed that the expression of UBC9 mRNA decreased in EGCG group(F=89.34,P<0.001), but increased in LPS group(F=225.00,P<0.001) compared with control group. Compared to LPS group, the expression of UBC9 mRNA in EGCG plus LPS group was inhibited and reduced significantly(F=625.00,P<0.001).Conclusions EGCG can down-regulate the expression of UBC9 in the inflammatory model induced by LPS.The anti-inflammatory mechanism of EGCG might be mediated by suppression of UBC9 protein and mRNA expression.

epigallocatechin gallate; lipopolysaccharide; ubiquitin-conjugating enzyme 9; inflammation

山東省自然科學基金資助課題 (ZR2012CM008)

曹留霞，碩士，主治醫(yī)師。

100088 北京，火箭軍總醫(yī)院感染性疾病科

武澗松，E-mail: jiulihe66@126.com

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