徐 勁,喬 麗,楊志勇,劉 瑋

Caspase-3對5-ALA誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡效應(yīng)的影響

徐 勁,喬 麗,楊志勇,劉 瑋

目的 探討半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)對光敏劑5-氨基酮戊酸(5-ALA)誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡效應(yīng)的影響。方法 取對數(shù)生長期的Colo-16細胞用于實驗，將細胞分為對照組、5-ALA-光動力療法(photodynamic therapy,PDT)組和Caspase-3抑制劑組(Z-DEVD-FMK)，對照組不給予光敏劑和照光處理，5-ALA-PDT組給予0.4 mg/ml的5-ALA避光孵育4 h后，采用(功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2)激光照射3 min，之后繼續(xù)培養(yǎng)12 h。Caspase-3抑制劑組除孵育時同時加入Z-DEVD-FMK(終濃度40 μmol)，其余處理與5-ALA-PDT組相同。實驗后收集各組細胞，通過免疫熒光觀察各組細胞胞內(nèi)Caspase-3熒光強度的變化，通過流式細胞術(shù)檢測活性Caspase-3陽性細胞百分率和細胞凋亡率。結(jié)果 免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組和Caspase-3抑制劑組Colo-16細胞胞漿中有微弱綠色熒光，表明Caspase-3表達量低，而5-ALA-PDT組中綠色熒光顯著增強，表明其胞漿內(nèi)Caspase-3含量顯著增高。流式細胞儀的檢測結(jié)果顯示，對照組、5-ALA-PDT組和Caspase-3抑制劑組active-Caspase-3陽性細胞百分率分別為(2.26±0.16)%、(32.16±1.31)%和(3.36±0.31)%，5-ALA-PDT組高于對照組和Caspase-3抑制劑組，差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。對照組、5-ALA-PDT組和Caspase-3抑制劑組的凋亡率分別為(2.35±0.22)%、(31.55±3.68)%和(11.46±2.25)%，三組之間兩兩比較，差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論 5-ALA-PDT可以誘導Colo-16細胞發(fā)生凋亡，且這種效應(yīng)與caspase-3的激活密切相關(guān)。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；鱗狀細胞癌；Colo-16細胞；5-氨基酮戊酸；細胞凋亡

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種治療腫瘤的新方法，在多種惡性腫瘤的臨床實驗研究中取得了滿意的療效[1]。目前研究表明，PDT誘導腫瘤細胞凋亡是其發(fā)揮抗腫瘤療效的重要機制之一。細胞中主要存在兩條凋亡信號轉(zhuǎn)導通路，即死亡受體通路和線粒體通路，而這兩條通路激活后最終均需要經(jīng)過Caspase-3來執(zhí)行凋亡效應(yīng)，因此Caspase-3是凋亡通路中的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白[2-6]?；谏鲜鲅芯窟M展，本研究假設(shè)Colo-16細胞在經(jīng)過5-ALA-PDT照射后可導致Caspase-3的活化從而引起腫瘤細胞凋亡，進一步探討5-ALA-PDT 誘導Colo-16細胞凋亡的分子機制打下基礎(chǔ)，并為臨床5-ALA-PDT治療皮膚鱗狀細胞癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 Colo-16細胞，南京皮膚病研究所惠贈。主要試劑5-ALA(購于Sigma公司)；Caspase-3mAb (美國RD公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；細胞周期試劑盒(美國BD公司)；630 nm半導體紅光激光器(桂林興達光電醫(yī)療器械有限公司)；LM-93II型激光功率計(中國電子計量院)；Olympus-BH2型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞的培養(yǎng)及傳代 細胞培養(yǎng)：Colo-16細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，溫度37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。細胞傳代：待細胞80%～90%融合時，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液。按1∶2比例傳代培養(yǎng)。

1.3 實驗分組與處理 實驗分為對照組、5-ALA-PDT組和 Caspase-3抑制劑組。對照組不給予光敏劑和照光處理，5-ALA-PDT組給予0.4 mg/ml的5-ALA避光孵育4 h后，用激光照射3 min(功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2)，照光前后均監(jiān)測輸出功率，輸出功率波動范圍±5%，之后繼續(xù)培養(yǎng)12 h。Caspase-3抑制劑組除孵育時同時加入Z-DEVD-FMK(終濃度40 μmol)，其余處理與5-ALA-PDT組相同。實驗處理后收集細胞，進行下一步的檢測，每組實驗重復5次。

1.4 Caspase-3熒光染色及觀察 將滅菌后的蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸包被后置于6孔板中，加入一定量的細胞懸液，培養(yǎng)過夜待細胞完全貼壁后進行實驗。實驗后傾去培養(yǎng)液并用PBS洗滌，依次用4%濃度的多聚甲醛中處理20 min，用0.1% Triton x-100將細胞固定6 min。之后用PBS洗滌，并加入適量的Caspase-3單克隆抗體(santa Cat# sc-271759；1∶100稀釋)4 ℃孵育24 h。再用PBS洗滌并加入FITC-綴合山羊抗鼠免疫球蛋白(中杉金橋 ZF-0312；1∶1000稀釋)室溫孵育40 min。加入PI(150 mmol/L)并在熒光顯微鏡下觀察Caspase-3的熒光強度。

1.5 流式細胞技術(shù)檢測active-Caspase-3的表達 染色方法和檢測方法參照試劑盒的說明書進行。收集各組細胞，離心后用PBS洗滌各組細胞2次，再次離心后用Binding Buffer制成總數(shù)為1×105細胞/毫升的重懸液。用Cytofix/CytopermTM(BD公司,美國)破細胞膜后加入Caspase-3 mAb(1∶50)，室溫下避光孵育2 h；用PBS洗滌3次后加入用FITC標記的二抗(1∶100)，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測分析。每標本計數(shù)105個細胞，每組實驗重復5次。FITC的EM波長為525 nm，EX波長為488 nm。

1.6 PI染色法檢測Colo-16細胞的凋亡率 染色及檢測方法按照試劑盒的說明書進行。分別收集各組細胞，經(jīng)胰酶消化后用PBS制成單細胞懸液，乙醇4 ℃固定過夜。上機檢測前用PBS洗去乙醇后離心，再用PBS(RNaseA 0.1 μg/ml和PI 40 μg/ml)重新懸浮細胞，37 ℃避光孵育15 min，最后經(jīng)流式細胞儀檢測及分析。每組實驗重復5次。PI的EM為633 nm，EX波長為488 nm。

2 結(jié) 果

2.1 5-ALA-PDT誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡中Caspase-3表達的變化 經(jīng)FITC-Caspase-3和PI染色后在熒光顯微鏡下觀察到，各組Colo-16細胞爬片上都有散在的細胞核結(jié)構(gòu)，核大圓形或橢圓形，染色呈紅色。對照組可以觀察到雙核細胞，表明該組細胞仍然處于分裂增殖階段。對照組和Caspase-3抑制劑組Colo-16細胞的細胞漿中有微弱綠色熒光，表明Caspase-3表達量低，5-ALA-PDT組中綠色熒光顯著增強，表明其胞漿內(nèi)Caspase-3含量增高(圖1)。流式細胞儀的檢測結(jié)果顯示，對照組、5-ALA-PDT組和Caspase-3抑制劑組active-Caspase-3陽性細胞百分率分別是(2.26±0.16)%、(32.16±1.31)%和(3.36±0.31)%，5-ALA-PDT組高于對照組和Caspase-3抑制劑組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 抑制 Caspase-3活化對5-ALA誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡的影響 對照組、5-ALA-PDT組和Caspase-3抑制劑組的凋亡率分別為(2.35±0.22)%、(31.55±3.68)%和(11.46±2.25)%，3組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 免疫熒光觀察5-ALA-PDT 處理后胞漿中

3 討 論

隨著激光系統(tǒng)和光敏劑的不斷發(fā)展，光動力日益成為治療腫瘤的新方法，被廣泛應(yīng)用于臨床中。光動力已經(jīng)被用于皮膚鱗狀細胞癌的治療性和姑息性處理，也常應(yīng)用于一些較大區(qū)域而且淺層或有多種腫瘤同時存在的皮膚癌的治療。PDT處理后的病變區(qū)域外觀好，不遺留瘢痕，避免了外科手術(shù)瘢痕給患者造成的精神痛苦。光動力導致腫瘤細胞的凋亡主要體現(xiàn)在3個方面：(1)腫瘤細胞的直接殺傷作用；(2)通過作用于腫瘤組織的微血管造成血管完全封閉，使腫瘤組織缺氧，從而導致腫瘤組織壞死；(3)調(diào)節(jié)免疫的作用。腫瘤細胞經(jīng)過PDT作用后主要以凋亡或壞死為主。光動力能引起細胞以凋亡、壞死和自噬三種不同形式死亡，其對腫瘤的治療作用主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡而產(chǎn)生的[4,7]。Caspase-3起執(zhí)行細胞凋亡、剪切凋亡底物作用，是最重要的凋亡執(zhí)行因子。因此，探索Caspase-3在光動力治療腫瘤中的變化規(guī)律及其生物學作用具有重要作用。

本研究結(jié)果表明，PDT治療后Colo-16細胞凋亡率顯著上升，同時胞內(nèi)Caspase-3的表達量也顯著上升。而采用Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK后可顯著抑制PDT誘導的胞內(nèi)Caspase-3的表達，并緩解PDT治療誘導的細胞凋亡。此外，盡管Z-DEVD-FMK可以特異性抑制Caspase-3的活性，但該組細胞經(jīng)5-ALA-PDT作用后凋亡率仍明顯高于對照組，表明5-ALA-PDT誘導COLO-16細胞發(fā)生凋亡效應(yīng)并不僅僅依賴于Caspase-3的激活，可能還與信號傳導途徑的激活或其他因子的釋放有關(guān)。由于PDT誘導腫瘤細胞凋亡是一個多因素參與的復雜反應(yīng)體系[8-11]，還需要進一步研究和完善凋亡的各種機制。

綜上所述，本研究檢測了在5-ALA-PDT誘導COLO-16細胞發(fā)生死亡效應(yīng)時Caspase-3的表達及活化情況，并探討了其與COLO-16細胞凋亡的關(guān)系。結(jié)果表明在5-ALA-PDT治療后，COLO-16細胞中活化的caspase-3顯著增加，從而導致了腫瘤細胞的凋亡。下一步，還將深入研究5-ALA-PDT誘導的腫瘤細胞凋亡的機制，從而為臨床上廣泛應(yīng)用5-ALA-PDT治療皮膚鱗狀細胞癌提供了理論依據(jù)。

[1] 劉慧龍，劉端祺，介雅慧，等. 激光光動力療法治療皮膚惡性腫瘤的臨床研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志，2007，32(4): 396-397.

[2] Dolmans D E，F(xiàn)ukumura D，Jain R K. Photodynamic therapy for cancer[J]. Nat Rev Cancer，2003,3(5):380-387.

[3] Buytaert E，Dewaele M，Agostinis P. Molecular effectors of multiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy [J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1776(1): 86-107.

[4] Garg A D，Nowis D，Golab J，etal. Photodynamic therapy: illuminating the road from cell death towards anti-tumour immunity [J]. Apoptosis, 2010, 15(9): 1050-1071.

[5] Kim K H, Park J J. The effects of photodynamic therapy in upper-gastrointestinal malignant diseases [J]. Gut Liver, 2010, 4(Suppl1): S39-S43.

[6] Tirapelli L F, Morgueti M, Cunha Tirapelli D P,etal. Apoptosis in glioma cells treated with PDT [J]. Photomed Laser Surg, 2011, 29(5): 305-309.

[7] Castano A P, Demidova T N, Hamblin M R. Mechanisms in photodynamic therapy: part one-photo sensitizers, photochemistry and cellular localization [J]. Photodiagn Photodyn, 2004, 1(4): 279-293.

[8] Yang L, Wei Y, Xing D,etal. Increasing the efficiency of photodynamic therapy by improved light delivery and oxygen supply using an anticoagulant in a solid tumor model [J]. Lasers Surg Med,2010,42(7):671-679.

[9] Weiss A, den Bergh H V, Griffioen A W,etal. Angiogenesis inhibition for the improvement of photodynamic therapy: The revival of a promising idea [J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1826(1): 53-70.

[10] Kessel D, Oleinick N L. Initiation of autophagy by photodynamic therapy [J]. Methods Enzymol, 2009, 453: 1-16.

[11] Ji H T, Chien L T, Lin Y H,etal. 5-ALA mediated photodynamic therapy induces autophagic cell death via AMP-activated protein kinase [J]. Mol Cancer, 2010, 9(4): 91-101.

(2016-10-20收稿 2016-12-10修回)

(責任編輯 武建虎)

Effects of caspase 3 on apoptosis of squamous-cell carcinoma Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT

XU Jin, QIAO Li, YANG Zhiyong, and LIU Wei.

Department of Dermatology, General Hospital of Air Force, Beijing 100142, China

Objective To investigate the role of caspase-3 in the apoptosis of squamous-cell carcinoma Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT.Methods Colo-16 cells in the logarithmic growth phase were divided into three groups: control group, 5-ALA photodynamic therapy (PDT) group, and caspase-3 inhibitor group (Z-DEVD-FMK). Control group was not given photosensitizer or light treatment. 5-ALA PDT group was exposed to 3-minute laser irradiation at a power density of 10 mW/cm2 and energy density of 2.5 J/cm2 after 4 hours of dark incubation with 0.4 mg/ml 5-ALA before being cultured for 12 hours. Caspase3 inhibitor group was treated in the same way as 5-ALA PDT group except that Z-DEVD-FMK at a final concentration of 40 μmol was added during incubation. Cells in each group were collected after experiment, the changes of intracellular caspase-3 fluorescence intensity were observed by immunofluorescence, and the percentage of positive cells and apoptosis rate of active caspase-3 were detected by flow cytometry.Results Immunofluorescence results showed that there was weak green fluorescence in the cytoplasm of Colo-16 cells in control group and Caspase-3 inhibitor group, indicating a low expression of caspase-3, while green fluorescence was significantly enhanced in 5-ALA-PDT group, showing a significant increase of caspase-3 content in cytoplasm of Colo-16 cells. Flow cytometry results showed that the respective percentage of active caspase-3 positive cells was (2.26±0.16)%,(32.16±1.31)% and (3.36±0.31)% in control group, 5-ALA PDT group and caspase-3 inhibitor group respectively. The difference was statistically significant (P<0.05). The apoptosis rate of control group, 5-ALA PDT group and caspase-3 inhibitor group was (2.35±0.22)%,(31.55±3.68)% and (11.46±2.25)%, respectively. Paired comparison was made between the three groups, and the differences were statistically significant (P<0.01).Conclusions The apoptosis of Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT is closely related to the activation of caspase-3.

caspase-3; human cutaneous carcinoma cell line；Colo-16; 5-ALA-PDT; apoptosis

徐 勁, 碩士，主治醫(yī)師。

100142 北京，空軍總醫(yī)院皮膚科

喬 麗，E-mail：winhp2006@163.com

R739.5; R730.57