黃世明，陳 薇,張錦明,馬永強,岳建蘭，李彥峰,林志春

18F-ML-10監(jiān)測多柔比星誘發(fā)心臟毒性的可行性探討

黃世明1，陳 薇1,張錦明2,馬永強3,岳建蘭1，李彥峰1,林志春1

目的 探討放射性核素凋亡顯像劑18F-ML-10無創(chuàng)監(jiān)測多柔比星誘發(fā)心臟毒性的可行性。方法 36只KM小鼠隨機分為對照組、低劑量(15 mg/kg)多柔比星模型組和高劑量(20 mg/kg)多柔比星模型組，每組12只。對照組腹腔注射生理鹽水，多柔比星模型組腹腔注射一定劑量的多柔比星，48 h后進行小動物超聲檢測左室射血分?jǐn)?shù) (left ventricular ejection fraction, LVEF)，以及放射性顯像劑18F-ML-10與18F-FDG在小鼠體內(nèi)的生物分布并測定每克組織放射性攝取值(%ID/g)，處死的小鼠取出心臟進行caspase 3免疫組化檢測心肌細胞的凋亡情況。結(jié)果 超聲結(jié)果顯示低劑量組[LVEF=(59.49±5.32)%]與高劑量組LVEF=(52.41±6.47)%小鼠左室射血分?jǐn)?shù)明顯低于對照組LVEF=(70.58±5.06)%，18F-FDG在低劑量組(%ID/g=21.67±3.69)與高劑量組(%ID/g=15.58±1.92)的攝取也明顯低于對照組(%ID/g=36.18±3.65)，而凋亡顯像劑18F-ML-10在低劑量組(%ID/g=0.50±0.11)與高劑量組(%ID/g=1.100.55)的攝取明顯明顯高于對照組(%ID/g=0.02±0.02)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，caspase 3免疫組化顯示模型組心肌細胞發(fā)生明顯凋亡，與18F-ML-10在心臟的攝取相一致。結(jié)論 心肌細胞的凋亡是多柔比星誘導(dǎo)心臟毒性的重要途徑，特異性凋亡顯像劑18F-ML-10用于多柔比星誘發(fā)心肌細胞凋亡的毒性監(jiān)測具有較好的應(yīng)用前景。

多柔比星；心臟毒性；凋亡；18F-ML-10

多柔比星是蒽環(huán)霉素類使用最廣泛的藥物之一，屬于廣譜抗腫瘤藥物，是多種腫瘤標(biāo)準(zhǔn)化療方案的一線藥物，主要針對乳腺癌、淋巴瘤和白血病等其他腫瘤[1, 2]。多柔比星可誘發(fā)嚴(yán)重的心臟毒性反應(yīng)，常見的有心肌缺血、心肌梗死、心律失常、心衰(最嚴(yán)重)等，這種毒性作用具有累積性和劑量依賴性，從而影響其臨床使用[3]。多柔比星誘發(fā)心臟毒性主要通過DNA損傷、抑制DNA復(fù)制與蛋白合成、促進肌纖維退化、抑制特定基因轉(zhuǎn)錄等多種途徑，最終經(jīng)caspase 3途徑誘發(fā)心肌細胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致心臟收縮功能的降低與左心室重塑，從而出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀[4]。18F-ML-10是Aposense家族中的一種小分子示蹤劑，經(jīng)人體試驗證實，是一種非常安全、有效的凋亡示蹤劑[5, 6]，18F-ML-10與凋亡細胞的結(jié)合與caspases的激活等凋亡變化呈正相關(guān)，具有高特異性與靈敏性[7]。本研究擬通過研究凋亡顯像劑18F-ML-10在小鼠體內(nèi)分布，以探討特異性凋亡顯像劑18F-ML-10用于多柔比星誘發(fā)心肌凋亡毒性監(jiān)測的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)實驗動物：36只6～8周雄性昆明(KM)小鼠，體重20～25 g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～70%，照明12 h。(2)實驗試劑與耗材：多柔比星(PHR1789，sigma)、5%水合氯醛、anti-casepase 3抗體(ab44976，abcom)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9032，北京中衫金橋醫(yī)藥公司)、通用型SP檢測試劑盒(SP-9000，北京中衫金橋醫(yī)藥公司)，18F-ML-10、18F-FDG(解放軍總醫(yī)院合成提供)。小動物超聲(Visual Sonics view 2100)；井型γ探測儀(FT-603型，北京261廠)；熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)。

1.2 實驗方法 36只KM小鼠隨機分為3組，正常對照組、低劑量組、高劑量組，每組12只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。正常對照組腹腔注射生理鹽水，正常喂養(yǎng)，低劑量多柔比星模型組腹腔注射多柔比星(溶于生理鹽水)15 mg/kg，高劑量多柔比星模型組腹腔注射多柔比星(溶于生理鹽水)20 mg/kg，48 h后進行下一步實驗。

1.2.1 小鼠動物超聲 多柔比星注射48 h后，進行小動物超聲，檢測小鼠心功能變化，選用MS550心臟超聲探頭，頻率40 MHz，超聲切面選擇為胸骨旁左心室短軸切面獲得M型超聲圖像。超聲檢測指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、室間隔厚度(IVS)、左室后壁厚度(LVPWT)及心率，根據(jù)容量公式V=[7.0/(2.4+D)]×D3，計算左室舒張末期容積(LVEDV)和收縮末期容積(LVESV)，左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)=(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100%[8]。

1.2.218F-ML-10在KM小鼠體內(nèi)分布 48 h后，各組隨機取6只KM小鼠，通過尾靜脈注射0.2 ml(100 μG)18F-ML-10，給藥60 min后處死，先取小鼠的血、心、肝、脾、肺、腎、骨和肌肉分別稱重，在自動定標(biāo)器上進行γ射線放射性計數(shù)，減去背景放射性計數(shù)，根據(jù)放射性顯像劑的注射時間進行放射性校正，然后計算每克組織放射性攝取率(%ID/g)。

1.2.318F-FDG在KM小鼠體內(nèi)分布 各組48 h后取剩余6只KM小鼠，通過尾靜脈注射0.2 ml(100 uG)18F-FDG，其余步驟與測定18F -ML-10在KM小鼠的體內(nèi)分布相同，最后計算每克組織放射性攝取率(%ID/g)。

1.2.4 caspase 3免疫組化凋亡檢測 上述小鼠心臟測定完放射性計數(shù)后，將心臟放于新配制的4%多聚甲醛中固定24 h，而后蔗糖脫水，將心臟做連續(xù)短軸切片，迅速將切片貼于明膠預(yù)處理的載玻片上，晾干后置于-20 ℃冰箱中待用。

將各組小鼠心臟相同切片部位進行caspase 3免疫組化檢測。具體步驟： 3% H2O2孵育10 min， PBS洗3 min×3次，0.3%TritonX-100 孵育10min， PBS 洗3 min×3 次，滴加封閉用正常山羊血清工作液孵育15 min，直接去封閉液滴加兔抗鼠的caspase 3 一抗放入濕盒中4 ℃孵育過夜。第2天從4 ℃中取出濕盒于室溫中復(fù)溫30 min，PBS 洗3 min×3 次，滴加生物素化二抗工作液37 ℃孵育15 min，PBS 洗3 min×3 次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育15 min， PBS 洗3 min×3 次，而后DAB 顯色。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染6 min，鹽酸乙醇分化10 s，流水沖洗反藍10 min，依次在梯度乙醇中脫水，二甲苯透明后封片顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡染色變化。

2 結(jié) 果

2.1 超聲結(jié)果 對照組左室射血分?jǐn)?shù)為(70.58±5.06)%，低劑量組48 h后左室射血分?jǐn)?shù)為(59.49±5.32)%，明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組左室射血分?jǐn)?shù)為(52.41±6.47)%，明顯低于對照組與低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1、2)。

圖1 各組KM小鼠超聲心動圖檢測心臟短軸M-Mode

圖2 多柔比星注射48 h后各組KM小鼠左室

2.2 放射性顯像劑體內(nèi)分布18F-ML-10在對照組與實驗組KM小鼠體內(nèi)生物分布見表1，18F-FDG在小鼠體內(nèi)的生物分布見表2。特異性凋亡顯像劑18F-ML-10注射60 min后，相比于對照組(%ID/g =0.02±0.02)，18F-ML-10在低劑量組(%ID/g=0.50±0.11)與高劑量組(%ID/g=1.10±0.55)的心臟毒性動物模型中均有明顯攝取(P<0.05)，高劑量組比低劑量組的放射性攝取增加更明顯(P<0.05)。而糖代謝顯像劑18F-FDG在低劑量組(%ID/g=21.67±3.69)與高劑量組(%ID/g=15.58±1.92)的心臟毒性動物模型中的攝取均明顯低于對照組(%ID/g=36.18±3.65)(P<0.05)，高劑量組相比于低劑量組的18F-FDG放射性攝取降低更明顯(P<0.05)。

2.3 心肌細胞Caspase 3凋亡檢測 Caspase 3是凋亡過程中非常重要的執(zhí)行分子，Caspase3酶原被激活后，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細胞的凋亡，其免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：高劑量組caspase 3 抗體染色顏色最深，染色區(qū)域最大，低劑量組次之，而對照組染色為陰性(圖3)。

表1 18F-ML-10在KM小鼠體內(nèi)的分布 (n=6；

注：與正常對照組比比較，①P<0.05；與低劑量組比較，②P<0.05

表2 18F-FDG在KM小鼠體內(nèi)的分布 (n=6；

注：與對照組比比較，①P<0.05；與低劑量組(15mg/kg)比較，②P<0.05

圖3 KM小鼠腹腔注射多柔比星誘發(fā)急性心臟損傷48 h后心肌細胞的凋亡變化(caspase 3免疫組化染色，×200)

3 討 論

多柔比星一旦誘發(fā)心室功能障礙，預(yù)后極差，因此迫切需要一種有效、無創(chuàng)、實時、動態(tài)的早期監(jiān)測心臟毒性的方法，以利于早期使用心臟保護藥[9]，或及時調(diào)整腫瘤治療方案預(yù)防心衰同時避免抗腫瘤治療中斷，從而最大限度的降低心臟毒性風(fēng)險提高患者生存質(zhì)量并改善預(yù)后[10]。目前，對于心臟毒性的監(jiān)測方法有多種，包括組織活檢、血液標(biāo)志物檢測、超聲心動圖顯像等。心肌內(nèi)膜活檢反應(yīng)心臟毒性的敏感性較高，但并不能反應(yīng)心肌受損的嚴(yán)重程度和范圍，因有創(chuàng)、滯后、不能反復(fù)檢測等原因限制了其在臨床上的應(yīng)用。蒽環(huán)霉素治療可誘發(fā)肌鈣蛋白的升高，但一系列研究并沒有證明肌鈣蛋白的升高與蒽環(huán)霉素類藥物的注射量具有明顯的相關(guān)性[11]。超聲測定左室射血分?jǐn)?shù)是目前臨床上普遍接受的檢測方法，甚至作為臨床的標(biāo)準(zhǔn)，但LVEF只能是作為心臟功能受損嚴(yán)重程度的評估，當(dāng)組織活檢或其他生化指標(biāo)已經(jīng)顯示心肌受損時，心肌可能因代償作用而使LVEF沒發(fā)生明顯的變化，因此LVEF的下降不能用于早期監(jiān)測心臟毒性的風(fēng)險[12]。

導(dǎo)致心肌細胞凋亡是多柔比星誘發(fā)心臟毒性的重要機制之一，可導(dǎo)致心功能異常，早期監(jiān)測心肌細胞的凋亡可及早調(diào)整化療藥物并盡早使用心臟保護劑。目前已有一些凋亡顯像探針用于心臟毒性監(jiān)測的研究，包括Annexin-V、18F-CP18，不同的凋亡顯像劑靶向結(jié)合于凋亡的不同過程，然而目前仍沒有常規(guī)用于臨床PET顯像的凋亡顯像劑[13, 14]，18F-ML-10已用于人體顯像。臨床試驗表明，對人體安全、無副作用，體內(nèi)分布穩(wěn)定，劑量濃度與生物分布均較適宜能夠特異性的與凋亡細胞結(jié)合顯像[15]。

本研究利用多柔比星單次高劑量注射到KM小鼠體內(nèi)，小動物超聲檢測觀察到低劑量組與高劑量組小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)均明顯降低，與對照組比較，分別降低了15.7%與25.7%，表明小鼠心臟功能受損，多柔比星對小鼠心臟會產(chǎn)生較明顯的毒性作用。同時，糖代謝顯像劑18F-FDG在模型組心臟的分布明顯降低，表明多柔比星藥物誘發(fā)心臟毒性時，在急性期會導(dǎo)致心肌細胞糖代謝水平的下降，糖代謝供能降低。而凋亡顯像劑18F-ML-10在對照組小鼠心臟的分布(%ID/g =0.02±0.02)接近于本底，本研究結(jié)果表明，正常心肌細胞幾乎不攝取，而模型組心臟的放射性分布明顯的增加，同時caspase 3免疫組化檢測顯示對照組未發(fā)生明顯的凋亡，而模型組心肌細胞發(fā)生明顯的凋亡，驗證了心肌細胞的凋亡作用是多柔比星誘導(dǎo)心臟毒性重要途徑之一，表明18F-ML-10能夠有效地與多柔比星誘發(fā)的心肌凋亡細胞結(jié)合。

綜上所述，心肌細胞的凋亡是多柔比星誘發(fā)心臟毒性的重要作用途徑，18F-ML-10能夠特異性的與凋亡心肌細胞結(jié)合，有望成為無創(chuàng)監(jiān)測多柔比星誘發(fā)心臟毒性的凋亡顯像劑。

[1] Jean S R, Tulumello D V, Riganti C,etal. Mitochondrial Targeting of Doxorubicin Eliminates Nuclear Effects Associated with Cardiotoxicity[J]. ACS Chem Biol, 2015, 10(9):2007-2015.

[2] 王雅婧, 劉德權(quán), 葉劍橋. 多西他賽與表柔比星聯(lián)合或序貫化療治療局部晚期乳腺癌臨床觀察[J]. 武警醫(yī)學(xué), 2014, 25(09):921-923.

[3] Yancy C W, Jessup M, Bozkurt B,etal. 2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart failure: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J]. J Am Coll Cardiol, 2013, 62(16):e147-239.

[4] Cao Y, Ruan Y, Shen T,etal. Astragalus polysaccharide suppresses doxorubicin-induced cardiotoxicity by regulating the PI3k/Akt and p38MAPK pathways[J]. Oxid Med Cell Longev, 2014, 2014:674219.

[5] Hoglund J, Shirvan A, Antoni G,etal.18F-ML-10, a PET tracer for apoptosis: first human study[J]. J Nucl Med, 2011, 52(5):720-725.

[6] Oborski M J, Laymon C M, Lieberman F S,etal. First use of (18)F-labeled ML-10 PET to assess apoptosis change in a newly diagnosed glioblastoma multiforme patient before and early after therapy[J]. Brain Behav, 2014, 4(2):312-315.

[7] Hyafil F, Tran-Dinh A, Burg S,etal. Detection of Apoptotic Cells in a Rabbit Model with Atherosclerosis-Like Lesions Using the Positron Emission Tomography Radiotracer[18F]ML-10[J]. Mol Imaging, 2015, 14:433-442.

[8] Gardin J M, Siri F M, Kitsis R N,etal. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice[J]. Circ Res, 1995, 76(5):907-914.

[9] Kalam K and Marwick T H. Role of cardioprotective therapy for prevention of cardiotoxicity with chemotherapy: a systematic review and meta-analysis[J]. Eur J Cancer, 2013, 49(13):2900-2909.

[10] Curigliano G, Cardinale D, Dent S,etal. Cardiotoxicity of anticancer treatments: Epidemiology, detection, and management[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(4):309-325.

[11] Dodos F, Halbsguth T, Erdmann E,etal. Usefulness of myocardial performance index and biochemical markers for early detection of anthracycline-induced cardiotoxicity in adults[J]. Clin Res Cardiol, 2008, 97(5):318-326.

[12] Ewer M S ，Lenihan D J. Left ventricular ejection fraction and cardiotoxicity: is our ear really to the ground?[J]. J Clin Oncol, 2008, 26(8):1201-1203.

[13] Su H, Gorodny N, Gomez L F,etal. Noninvasive molecular imaging of apoptosis in a mouse model of anthracycline-induced cardiotoxicity[J]. Circ Cardiovasc Imaging, 2015, 8(2):e001952.

[14] Panjrath G S, Patel V, Valdiviezo C I,etal. Potentiation of Doxorubicin cardiotoxicity by iron loading in a rodent model[J]. J Am Coll Cardiol, 2007, 49(25):2457-2464.

[15] Allen A M, Ben-Ami M, Reshef A,etal. Assessment of response of brain metastases to radiotherapy by PET imaging of apoptosis with (1)(8)F-ML-10[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2012, 39(9):1400-1408.

(2016-08-11收稿 2017-02-01修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Feasibility of using18F-ML-10 to monitor cardiotoxicity induced by doxorubicin

HUANG Shiming1,CHEN Wei1,ZHANG Jinming2,MA Yongqiang3,YUE Jianlan1,LI Yanfeng1, and LIN Zhichun1.

1.Department of Nuclear Medicine, Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China;2. Department of Nuclear Medicine, the PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 3. Tianjin Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Target Organ Injury Institute of Cardiovascular Disease and Heart Center, Tianjin 300162，China

Objective To investigate the feasibility of noninvasive monitoring of doxorubicin-induced cardiotoxicity by radionuclide apoptosis imaging agent18F-ML-10.Methods Thirty-six KM mice were randomly and equally divided into control group, low dose (15 mg / kg) model group and high dose (20 mg/kg) model group. The mice in control group were injected with normal saline. Doxorubicin was injected into model group at some dose. After 48 hours, mice were subjected to cardiac ultrasonography and the biodistribution of18F-FDG and18F-ML-10 was determined with gamma counting. The mice were sacrificed to remove the heart for caspase 3 immunohistochemical detection of myocardial cell apoptosis.Results The left ventricular ejection fraction was significantly lower in low dose group (LVEF=59.49±5.32%) and high dose group (LVEF=52.41±6.47%) than that in control group (LVEF=70.58±5.06%), but the uptake of18F-FDG in low dose group (%ID/g=0.50±0.11) and high dose group (%ID/g=15.58±1.92) was significantly lower than that in control group (%ID/g=36.18±3.65).The uptake of apoptotic imaging agent18F-ML-10 in low dose group (%ID/g=0.50±0.11) and high dose group(%ID/g=1.10±0.55)was significantly higher than that in control group (%ID/g=0.02±0.02) (P<0.05). Caspase 3 immunohistochemistry showed obvious apoptosis of myocardial cells in model group, which was consistent with the uptake of18F-ML-10 in the heart.Conclusions Apoptosis is an important pathway for doxorubicin-induced cardiotoxicity.18F-ML-10 may contribute to the detection of doxorubicin-induced myocardial apoptosis.

doxorubicin; cardiotoxicity; apoptosis;18F-ML-10

天津市自然科學(xué)基金資助項目(13JCYBJC22000)，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金資助項目(FYQ201601)

黃世明，在讀碩士研究生。

1.300162 天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科；2.100853 北京，中國人民解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科；3.300162，天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室

林志春，E-mail: zhichunlin@163.com.

R817