劉紅堅，李松，游建華，何為中，劉俊仙，盧曼曼，劉麗敏，余坤興，劉欣

（廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所，廣西南寧530007）

甘蔗新品種桂糖47號的組織培養(yǎng)技術(shù)研究

劉紅堅，李松，游建華，何為中*，劉俊仙，盧曼曼，劉麗敏，余坤興，劉欣

（廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所，廣西南寧530007）

以桂糖47號為材料，以MS基本加外源激素濃度梯度進行試驗處理設(shè)計，對品種的愈傷誘導(dǎo)、愈傷分化、試管苗增殖和生根階段進行培養(yǎng)基篩選試驗，以期篩選出最合適桂糖47號的培養(yǎng)基配方。試驗結(jié)果表明：優(yōu)化的桂糖47號愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.5mg/L；愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+BA 1.0mg/L；增殖培養(yǎng)基為MS+BA 0.8mg/L+NAA 0.05mg/L；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 5mg/L，生根最好，苗綠、比較高，長勢好，對加快甘蔗新品種桂糖47號在廣西蔗區(qū)大面積推廣種植起到積極的作用。

甘蔗；桂糖47號；組織培養(yǎng)

常規(guī)的甘蔗加速繁殖系數(shù)低，1年僅增加種量15～20倍，極大地限制了甘蔗新品種的迅速推廣和應(yīng)用[1]。利用甘蔗組培技術(shù)實現(xiàn)工廠化育苗已成為快速繁殖推廣應(yīng)用甘蔗良種的有效途徑[2]。同時甘蔗組培技術(shù)作為一種有效的脫毒技術(shù)[3-7]，它可以把蔗株上的花葉病、宿根矮化病等用常規(guī)方法難以防治的病害減弱，生產(chǎn)健康種苗用于生產(chǎn)，增產(chǎn)增糖效果明顯。桂糖47號是廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所育成的新品種，親本為：粵糖85-177×CP81-1254，早熟，高糖，豐產(chǎn)，宿根性好，有效莖多，抗病性、抗倒性和宿根性好，是個有推廣潛力的新品種，為了加快繁殖這個優(yōu)良新品種，我們采用了組織培養(yǎng)的方式對其進行快速繁殖，加快桂糖47號新品種的大面種推廣。桂糖47號的高效組織培養(yǎng)技術(shù)沒有報道，本研究通過篩選愈傷誘導(dǎo)、愈傷分化、增殖、生根培養(yǎng)基，研制出適合桂糖47號的高效組織培養(yǎng)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在晴天上午，選取無病蟲害、生長健壯的桂糖47號蔗莖梢部作外植體，蔗莖梢段剝除2～3層外葉鞘，切取長約15 cm的莖段，用75%酒精擦洗外部及兩端切口置超凈工作臺上，再用75%酒精擦洗1次供接種用。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)試驗在愈傷組織誘導(dǎo)階段選取MS作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2，4-D，分別是1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mg/L，每處理3個重復(fù)，每個重復(fù)60瓶，培養(yǎng)10d后統(tǒng)計愈傷組織生長情況，計算公式：愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=誘出愈傷組織瓶數(shù)/（接種總瓶數(shù)-污染瓶數(shù)）×100%

1.2.2 分化培養(yǎng)試驗從愈傷分化出小苗階段選用不同濃度的細胞分裂素會對小苗分化產(chǎn)生不同的影響，在試驗中選用的細胞分裂素為6-芐基腺嘌呤（6-BA），生長素為萘乙酸（NAA），試驗設(shè)：①MS+BA 0.5mg/L+ NAA 0.01mg/L；②MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L；③MS+BA 1.5mg/L+NAA 0.01mg/L；④MS+BA 2.0mg/L+ NAA 0.01mg/L；⑤MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.01mg/L。每處理3個重復(fù)，每個重復(fù)60瓶，培養(yǎng)15d后統(tǒng)計出現(xiàn)綠芽愈傷組織數(shù)量，計算公式：分化率（%）=綠芽愈傷組織瓶數(shù)/（接種總瓶數(shù)-污染瓶數(shù)）×100%

1.2.3 第3～4代甘蔗苗增殖試驗在增殖培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-芐基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA），試驗設(shè)計不同處理培養(yǎng)基：①MS；②MS+BA 0.4mg/L+NAA 0.05mg/L；③MS+BA 0.8mg/L+NAA 0.05mg/L；④MS+BA 1.6 mg/L+NAA 0.05mg/L；⑤MS+BA 3.2mg/L+NAA 0.05mg/L。每處理3個重復(fù)，每個重復(fù)120瓶，培養(yǎng)20d后調(diào)查株高、莖徑，統(tǒng)計增殖苗數(shù)和增殖繼代系數(shù)。

增殖繼代系數(shù)（倍）=增殖后總苗數(shù)/增殖基數(shù)

1.2.4 生根培養(yǎng)試驗生根階段不同濃度生長素萘乙酸（NAA）對桂糖47號增殖苗生根有不同的效果。本試驗設(shè)計不同濃度的生根培養(yǎng)基4處理，A：1/2 MS+NAA 2.5 mg/L；B：1/2 MS+NAA 5.0mg/L；C：1/2MS+ NAA7.5mg/L；D：1/2 MS+NAA 10.0 mg/L。每處理3個重復(fù)，每個重復(fù)75瓶，培養(yǎng)21天后統(tǒng)計生根數(shù)、生根率、平均根數(shù)、平均根長都是以接種后21d計算。觀察各不同培養(yǎng)基處理之間生根率的差異。

生根率（%）=（21d生根瓶數(shù)-污染瓶數(shù)）/接種總瓶數(shù)×100%

平均根數(shù)=每瓶根數(shù)相加/生根瓶數(shù)；平均根長=每瓶根長相加/生根瓶數(shù)

1.3 培養(yǎng)條件

所有材料接種后均置于實驗室中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：愈傷組織誘導(dǎo)階段為暗培養(yǎng)；分化和增殖、生根階段為光培養(yǎng)，光照強度為2000 lx。培養(yǎng)室內(nèi)溫度為28±2℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

從表1可以看出，6種不同濃度的2，4-D對桂糖47號愈傷組織的誘導(dǎo)率相差很大。2，4-D濃度在1.0時平均誘導(dǎo)率才有36.63%，當2，4-D濃度在1.0～2.5mg/L遞增時，甘蔗愈傷組織誘導(dǎo)率也遞增，2，4-D濃度達到2.5 mg/L時誘導(dǎo)率達到93.64%，其愈傷組織誘導(dǎo)率高于其它濃度處理，愈傷組織誘導(dǎo)率與其它處理的差異達到極顯著水平，誘導(dǎo)出的愈傷組織乳白色，結(jié)實不松散，色澤鮮。2，4-D濃度達到3.0mg/L、4.0mg/L時，誘導(dǎo)率有所下降，而且愈傷組織出現(xiàn)水漬狀，松散，色暗，長得不好，所以桂糖47號誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)基中添加的2，4-D濃度為2.5 mg/L時最佳。

2.2 分化培養(yǎng)

桂糖47號愈傷組織分化成苗受到6-芐基腺嘌呤（6-BA）細胞分裂素的影響。從表2可以看出，添加不同濃度的細胞分裂素6-BA，誘導(dǎo)分化成苗的結(jié)果不一樣，培養(yǎng)基①中加入的BA 0.5 mg/L時分化率是53.5%，②中BA1.0 mg/L處理的分化率達到93.6%，高于其它6-BA濃度處理，并且分化率與其它濃度處理的差異達到極顯著水平，該處理分化出的小苗數(shù)多，綠且壯。處理③和處理④的平均分化率分別達到91.9%和88.2%，但兩者間的分化率差異沒有達到顯著差異水平，其分化率略低于處理②，高于處理①和處理⑤；然而隨著6-BA濃度的增大，分化率有所下降，且因為6-BA的濃度過高，分化出的小苗葉子有水漬玻璃狀，生長勢不好，因此桂糖47號愈傷組織分化小苗選用②號培養(yǎng)基是綠苗分化階段比較理想的組合濃度。

2.3 增殖培養(yǎng)

不同濃度的6-芐基腺嘌呤（6-BA）對桂糖47號增殖苗株高、莖徑、增殖系數(shù)有影響（見表3）。從表3可知，各處理株高由大到小順序為處理③＞處理②＞處理①＞處理⑤＞處理④，且處理③的株高與其它處理株高的差異達到極顯著水平，處理②與處理①的株高差異不顯著；各自處理的平均莖徑差異不顯著;各處理增殖系數(shù)由大到小順序為處理③＞處理④＞處理②＞處理⑤＞處理①，且處理③的增殖系數(shù)與其它處理的差異達到極顯著水平，處理④、處理②和處理⑤的增殖系數(shù)間差異不顯著。桂糖47號的組培苗增殖快，苗細，株高總體都不高，偏矮，莖徑偏細，不夠壯，綜合來看，長勢最好的是③號培養(yǎng)基，其次是②號培養(yǎng)基，③號培養(yǎng)基最適宜桂糖47號增殖培養(yǎng)。

2.4 生根培養(yǎng)

NAA為生長素類激素，低濃度時可以促進生長點生長，高濃度時則可以促進生根[8]。本試驗用不同濃度的NAA對桂糖47號誘導(dǎo)生根，分別于接種后21d調(diào)查生根情況（見表4），不同NAA濃度培養(yǎng)基的生根誘導(dǎo)效果差異較大，各處理出根率的排列順序為培養(yǎng)基B＞培養(yǎng)基C＞培養(yǎng)基D＞培養(yǎng)基A，且培養(yǎng)基B的生根率與其它處理的差異達到極顯著水平，培養(yǎng)基C和培養(yǎng)D生根率間的生根率差異不顯著，但比培養(yǎng)基A高，且差異達到極顯著水平；平均根長由長到短的排列順序為培養(yǎng)基B＞培養(yǎng)基D＞培養(yǎng)基C＞培養(yǎng)基A，而培養(yǎng)基B，D和C間的根長差異不顯著，但3個處理的根長與培養(yǎng)基A的差異都達到了極顯著水平。在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)桂糖47號很容易誘導(dǎo)出根，發(fā)根時間早，而且根的數(shù)量多。當A處理培養(yǎng)基中加入的NAA濃度為2.5mg/L時，生根率比較低，根的數(shù)量少，根短。NAA濃度的增加到5.0mg/L時（B處理），桂糖47號生根率最高，發(fā)根早，根壯、平均根多，最適宜種植。當NAA濃度達到7.5～10mg/L時（C、D處理），苗的生根率也可以，根數(shù)也多，但是根比較細，根總體質(zhì)量比較弱，影響苗的成活率。為了得到健壯的假植苗，桂糖47號生根培養(yǎng)基選擇B（1/2 MS+NAA 5.0mg/L）時，生根最好，發(fā)根快，根壯、根多。

表1 不同濃度2,4-D對桂糖47號愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Table 1. The effect of 2,4-D on callus induction rate of Guitang 47

表2 6-芐基腺嘌呤(6-BA)對桂糖47號綠苗分化的影響Table 2. The effect of 6-BA on green seedlings differentiation of Guitang 47

表3 6-芐基腺嘌呤(6-BA)對桂糖47號綠苗增殖的影響Table 3. The effect of 6-BA on green seedlings multiplication of Guitang 47

表4 不同NAA濃度對桂糖47號生根的影響Table 4. The effect of different NAA concentration on rooting of Guitang 47

3 小結(jié)與討論

甘蔗是一種含多元酚類較高的作物，尤其是幼嫩莖尖和嫩葉鞘含量更高。在進行組織培養(yǎng)時，制備外植體和繼代過程中細胞受到破壞，細胞內(nèi)的多元酚類化合物與多酚氧化酶接觸，將酚氧化成棕色的對細胞有害的醌類物質(zhì)，醌類富集越多，顏色越深，褐化越嚴重，細胞正常生理受到破壞就越嚴重，嚴重時還通過擴散污染培養(yǎng)基，這就是所謂的酚為害或酚污染[9]。

在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)在整個組培過程中均存在酚污染，對愈傷組織的誘導(dǎo)影響比較大，因為在接種愈傷時切面?zhèn)诒容^大，所以誘導(dǎo)愈傷組織時必須放在暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)，而且時間不宜過長，一般誘導(dǎo)培養(yǎng)7～10d，轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷組織分化成小苗。培養(yǎng)基中添加的2，4-D濃度直接影響愈傷組織的誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)桂糖47號愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.5mg/L。6-BA濃度影響愈傷組織分化成小苗，桂糖47號愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+BA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)出小苗數(shù)最多。

桂糖47號增殖培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA和NAA配比，才能得到較高的增殖系數(shù)。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)桂糖47號增殖快，增殖苗矮，苗細。通過反復(fù)篩選，增殖培養(yǎng)基為MS+BA 0.8mg/L+NAA 0.05mg/L，苗綠、增殖系數(shù)高，苗比較高，長勢好。

桂糖47號很容易發(fā)根，培養(yǎng)基中NAA濃度達到5.0 mg/L，發(fā)根早，發(fā)根數(shù)多，根壯，根布滿瓶底。

通過本技術(shù)加快桂糖47號的離體繁殖速度，對加快桂糖新品種桂糖47號在廣西大面積推廣種植會起到積極的作用。

[1]李海明，潘世明，李瑞美，吳松海.甘蔗組織培養(yǎng)中褐變的研究進展[J].甘蔗糖業(yè)，2003（4）：18-21.

[2]侯朝祥，趙培方，劉家勇，等.影響甘蔗莖尖組培苗假植成活質(zhì)量的幾個因素分析[J].中國糖料，2010，32（1）：40-41，43.

[3]李松，余坤興，劉麗敏，等.甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)研究[J].中國糖料，2010，32（4）：1-5，8.

[4]周明強，易代勇，班秀文，龔德勇，劉凡值.甘蔗脫毒種苗培育技術(shù)研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2006，34（1）：47-49.

[5]肖關(guān)麗，楊清輝，李富生，楊生超.甘蔗脫毒種苗組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國種業(yè)，2003（2）：27-28.

[6]賢武，王倫旺，唐仕云，劉海斌.桂糖21號等甘蔗新品種的莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2007，3（2）：142-144.

[7]劉麗敏，李松，戴友銘，余坤興，劉紅堅，淡明.甘蔗莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國糖料，2009，31（2）：18-20.

[8]劉麗敏，李松，余坤興，等.甘蔗新品系桂糖02-901和02-467組培苗生根試驗[J].中國糖料，2010，32（1）：27-29.

[9]秦廷豪，鄒宗蘭，吳才文.淺析甘蔗組培中的酚害[J].甘蔗，1997，4（2）：12-14.

Study on The Tissue Culture of New Sugarcane Variety GT47

LIU Hong-jian,LI Song,YOU Jian-hua,HE Wei-zhong*,LIU Jun-xian,LU Man-man, LIU Li-min,YU Kun-xing,LIU Xin
（Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007）

GuiTang 47 as material and MS basic medium plus different exogenous hormone concentration as gradient,in order to screen optimized medium component,screening medium was in the callus induction phase, callus differentiation phase,multiplication phase and rooted phase,respectively.The results showed that：optimizing callus induction medium was MS+2,4-D 2.5 mg/L；callus differentiation medium was MS+BA 1.0 mg/ L；multiplication medium was MS+BA 0.8 mg/L+NAA 0.05 mg/L;rooted medium was 1/2 MS+NAA 5 mg/L, under the condition,seedlings grew well，radication was better,meanwhile,seedling was greener and taller,which plays a positive role in improving area of the Guitang 47 in Sugarcane planting area in Guangx

sugarcane;GuiTang 47;tissue culture

S566.1

A

1007－2624（2017）02－0006－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.02.002

2016-12-26

國家星火計劃（2015GA90007）；廣西農(nóng)業(yè)科學院科技成果轉(zhuǎn)化基金（農(nóng)成轉(zhuǎn)2015001）和廣西農(nóng)業(yè)科學院科技發(fā)展基金（2015JZ04）。

劉紅堅（1976-），女，廣西南寧市人，助理研究員，主要從事甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)和理化誘變育種研究。E-mail：blackjacket@126.com

何為中（1965-），男，研究員。