崔相勇，穆姣姣，周長民，張鳳清，陳學(xué)輝

（沈陽食品檢驗(yàn)所，沈陽 110022）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定花椒粉中的松香酸

崔相勇，穆姣姣，周長民，張鳳清，陳學(xué)輝

（沈陽食品檢驗(yàn)所，沈陽 110022）

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）法來測定花椒粉中松香酸的含量。提取方法采用乙醇超聲提取法，以乙腈及水（含0.1%甲酸）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用反相高效液相色譜分離，通過帶有電噴霧離子化源的串聯(lián)質(zhì)譜儀，以多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。該法線性范圍為0.1～2mg/kg，平均回收率為90%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤8.8%，方法的檢出限為0.1mg/kg。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；松香酸；花椒粉；測定；多反應(yīng)監(jiān)測模式

松香酸為松香的主要成分，松香為松科植物馬尾松或其同屬植物樹干中取得的油樹脂，經(jīng)蒸餾除去揮發(fā)油后的遺留物。松香中主要成分為樹脂酸，約占85%～95%，而松香酸是樹脂酸的主要成分［1］。有些不法商販在花椒粉生產(chǎn)過程中添加松香，推測目的是為了起到防腐和加香的作用，因此建立花椒粉中松香酸的檢測方法就顯得尤為必要，進(jìn)而檢測摻假的花椒粉。目前，測定松香酸的方法主要有高效液相色譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［2－6］，測定花椒粉中的松香酸還未見報(bào)道。本研究采用LC-MS/MS法來測定花椒粉中的松香酸，提取試劑為乙醇，以乙腈及水（含0.1%甲酸）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)過反相色譜分離后以多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。

1 材料和方法

1.1 儀器

API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有離子噴霧離子源以及Analysis 1.4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Applied Biosystem公司；LC-20A液相色譜儀（包括二元輸液泵及自動進(jìn)樣器） 日本島津公司。

1.2 藥品及試劑

松香酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量85.0%），批號：173130250，購自Sigma公司；乙醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為高純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

精密稱取松香酸0.1000g于100mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。此標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液每1mL相當(dāng)于1.0mg松香酸。

1.4 色譜條件

色譜柱：資生堂C8柱（2.1mm×50mm，3.5μm顆徑）；流動相：乙腈-水（含0.1%甲酸）；流速：0.4mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.5 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子化源；離子噴射電壓：5000V；溫度：550℃；源內(nèi)氣體1（GS1，N2）壓力：60psi；氣體2（GS2，N2）壓力：60psi；氣簾氣體（N2）壓力：15psi；正離子方式檢測；松香酸的解簇電壓（DP）為55V，碰撞能量（CE）為20eV；用于定量分析的離子反應(yīng)為303.4～123.5m/z；用于監(jiān)測的離子反應(yīng)為303.4～149.3m/z，碰撞能量（CE）為26eV；松香酸結(jié)構(gòu)及［M＋H］＋的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 松香酸的結(jié)構(gòu)及［M＋H］＋的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖

1.6 花椒粉樣品的預(yù)處理

稱取花椒粉樣品1g（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入20mL乙醇，渦旋混勻后超聲提取20min，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，并用乙醇定容至刻度，搖勻后吸取一定量液體經(jīng)0.22μm濾膜過濾，取20μL供LC-MS/MS分析。

1.7 空白花椒粉萃取液制備

選擇在生產(chǎn)過程中未添加松香的花椒粉。按1.6試樣處理方法提取，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾。必要時(shí)進(jìn)行LC-MS/MS分析，以確定在松香酸出峰處不存在干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為和專屬性

按“花椒粉樣品的預(yù)處理”操作，分別制備空白花椒粉樣品、空白花椒粉加入松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（相當(dāng)于含2mg/kg松香酸的花椒粉樣品）進(jìn)行測試。典型色譜圖分別見圖2中A和B。結(jié)果表明：空白花椒粉中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾松香酸的測定。

圖2 測定花椒粉中松香酸的典型MRM色譜圖

2.2 線性范圍和靈敏度

取空白花椒粉萃取液，依次加入適量松香酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成相當(dāng)于花椒粉濃度為0.1，0.2，0.5，1，2mg/kg的樣品萃取液，按“花椒粉樣品的預(yù)處理”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖；以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。結(jié)果表明：松香酸在0.1～2mg/kg范圍內(nèi)線性良好，方法檢出限為0.1mg/kg（信噪比S/N＝3）。

圖3 測定花椒粉中松香酸的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 回收率和精密度

試驗(yàn)分別制備了相當(dāng)于含松香酸0.1，0.5，2mg/kg的低、中、高3個(gè)濃度花椒粉樣品，按1.6項(xiàng)的操作方法進(jìn)行處理，每濃度六樣本分析，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，以當(dāng)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的測得濃度，求得本法的精密度與回收率。低、中、高3個(gè)濃度的回收率范圍分別為90%～97%，92%～100%和91%～103%，精密度分別為5.5%，4.6%和8.8%，結(jié)果均符合相關(guān)要求。

2.4 討論

2.4.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件優(yōu)化按以下步驟完成：將濃度為1μg/mL的松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸入注射器中，放在蠕動泵進(jìn)樣器上，設(shè)置蠕動泵以20μL/min的速度進(jìn)樣，對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，盡可能地使待測物響應(yīng)信號達(dá)到最高。在優(yōu)化過程中比較了松香酸正、負(fù)兩種離子化方式的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)正離子化效率高于負(fù)離子化效率，而且正離子響應(yīng)較為穩(wěn)定，因此選擇正離子掃描方式。

經(jīng)過Q1全掃描，選擇了響應(yīng)信號最高的303.4m/z作為松香酸定量分析的母離子，在子離子掃描方式下，尋找到了一些碎片離子，其中123.5m/z響應(yīng)最高，149.3m/z次之，在多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式下，選擇303.4～123.5m/z用于松香酸的定量分析。在蠕動泵持續(xù)進(jìn)樣的情況下，對各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使得待測物響應(yīng)值達(dá)到最高。

2.4.2 色譜條件優(yōu)化

雖然質(zhì)譜分析的專屬性較高，但是還需要將樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)與待測物進(jìn)行分離，以減少對測定產(chǎn)生干擾，所以在試驗(yàn)過程中對色譜條件進(jìn)行了選擇及優(yōu)化。

松香酸在小粒徑的C18色譜柱上保留較強(qiáng)，色譜峰峰形較差，故試驗(yàn)中選擇了保留能力較弱的C8柱。應(yīng)用反相色譜條件時(shí)，LC-MS/MS分析方法應(yīng)用的有機(jī)相主要為甲醇和乙腈，選用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，松香酸的色譜行為較好。試驗(yàn)中考慮到甲酸能夠改善峰形，使待測物與內(nèi)源性物質(zhì)充分分離，所以選擇了0.1%的甲酸作為水相。

2.4.3 提取條件的選擇

試驗(yàn)中考察了甲醇和乙醇作為提取試劑的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇的提取效率稍高于甲醇，而超聲提取的使用同樣會提高待測物的提取效率，所以最終選擇了用乙醇作為提取試劑進(jìn)行超聲提取。

2.4.4 實(shí)際樣品檢測

在市面上隨機(jī)購買了15批次的花椒粉樣品，均未檢出松香酸。

3 總結(jié)

本研究首次采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來測定花椒粉中的松香酸，方法采用MRM進(jìn)行定量，提高了選擇性與專屬性，排除了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。該法靈敏度較高，檢出限達(dá)到0.1mg/kg，前處理方法簡單，可應(yīng)用于食品安全檢測，有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

［1］李富賢，米彩峰，石會麗.RP-HPLC測定清毒素膠囊中松香酸的含量［J］.中國中藥雜志，2008，33（9）：1086-1087.

［2］仇雅靜.高效液相色譜法檢查骨筋丸膠囊中非法添加的松香酸［J］.藥物鑒定，2011，20（4）：39.

［3］張妤琳，曹玲，譚力，等.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)用于沉香中非法摻入含松香酸類物質(zhì)的檢測［J］.中成藥，2011，33（5）：844-847.

［4］陳安珍，沙啟營，單秀明，等.跌打片中松香酸的HPLC和HPLC-MS/MS檢測方法研究［J］.中成藥，2013，35（9）：1940-1942.

［5］王英鋒，魏小燕.HPLC測定楓香脂堿提物中脫氫松香酸和松香酸的含量［J］.中國中藥雜志，2013，38（1）：57-58.

［6］張?zhí)K珍，耿志明，王道營.固相萃取-高效液相色譜法檢測肉鴨表皮組織中的松香酸［J］.食品科學(xué)，2014，35（4）：82-85.

Determination of Abietic Acid in Pepper Powder by LC-MS/MS

CUI Xiang－yong，MU Jiao-jiao，ZHOU Chang-min，ZHANG Feng－qing，CHEN Xue-hui
（Shenyang Food Inspection Institute，Shenyang 110022，China）

To develop and validate a sensitive and specific LC-MS/MS method for the determination of abietic acid in pepper powder.The analyte is extracted from pepper powder by ethanol and separated by RP-HPLC with acetonitrile and 0.1%formic acid as the mobile phase.Detection is carried out by multiple reaction monitoring（MRM）on an API 4000LC-MS/MS system with an electrospray ionization（ESI）interface.The assay is linear in a range of 0.1～2mg/kg，and the average recovery is 90%～103%with RSD≤8.8%.The detection limit of the method is 0.1mg/kg.

LC-MS/MS；abietic acid；pepper powder；determination；MRM

TS264.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.030

1000-9973（2017）03-0127-03

2016－09－12

崔相勇（1985－），男，吉林安圖人，工程師，碩士，研究方向：藥物分析與食品檢測。