張?zhí)N鑫 劉建龍 賈 偉 田 軒 蔣 鵬 程志遠(yuǎn)

(北京積水潭醫(yī)院血管外科，北京 100035)

P-選擇素、溶酶體顆粒糖蛋白、血小板活化因子和血漿D-二聚體水平與下肢深靜脈血栓形成的關(guān)系

張?zhí)N鑫 劉建龍 賈 偉 田 軒 蔣 鵬 程志遠(yuǎn)

(北京積水潭醫(yī)院血管外科，北京 100035)

目的 探討血小板表面P-選擇素(CD62P)、溶酶體顆粒糖蛋白(CD63)、血小板活化因子(PAF)、血漿D-二聚體(D-D)與下肢深靜脈血栓形成的關(guān)系。方法 171例下肢深靜脈血栓形成患者為病例組，并給予常規(guī)治療，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)治療前、治療后7 d的血漿CD62P和CD63的陽(yáng)性率，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定治療前、治療后7 d血清PAF和血漿D-D水平，分析CD62P、CD63、PAF、D-D與雙下肢周徑差的關(guān)系，并與同期隨機(jī)選取60例無(wú)血管相關(guān)疾病的對(duì)照組患者進(jìn)行比較。結(jié)果 病例組治療前CD62P、CD63陽(yáng)性率及PAF、D-D水平高于對(duì)照組(P<0.05)；治療后均降低，且仍高于對(duì)照組(P<0.05)。與治療前相比，病例組治療后7 d膝上15 cm、膝下10 cm患肢與健肢周徑差均降低(P<0.05)。經(jīng)Pearson積矩相關(guān)分析，病例組治療前CD62P、CD63、PAF、D-D與膝上15 cm、膝下10 cm患肢與健肢周徑差均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論 CD62P、CD63、PAF和血漿D-D與下肢深靜脈血栓形成有密切關(guān)系，聯(lián)合檢測(cè)可作為早期診斷和早期預(yù)測(cè)下肢深靜脈血栓形成的重要指標(biāo)。

下肢深靜脈血栓；血小板表面P選擇素；溶酶體顆粒糖蛋白；血小板活化因子；血漿D-二聚體

下肢深靜脈血栓形成的過(guò)程中，血小板的活化、血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在血栓的形成過(guò)程中有重要作用。P-選擇素(CD62P)在靜止血小板的α顆粒及活化的血小板質(zhì)膜上的膜糖蛋白顆粒均有表達(dá)，是評(píng)估血小板活化的“金標(biāo)準(zhǔn)”〔1〕，溶酶體顆粒糖蛋白(CD63)、D-二聚體(D-D)是反映凝血和纖溶系統(tǒng)成分的指標(biāo)，當(dāng)血液處于高凝狀態(tài)時(shí)血小板功能增強(qiáng)，此時(shí)體內(nèi)血液凝固性增強(qiáng)，同時(shí)存在繼發(fā)性纖溶性亢進(jìn)，CD63和D-D水平升高〔2〕，血小板活化因子(PAF)通過(guò)促進(jìn)血小板的聚集而誘導(dǎo)血栓的形成，是反映血小板形成的標(biāo)志物〔3〕。本研究旨在探討CD62P、CD63陽(yáng)性率以及血清PAF和血漿D-D水平與下肢深靜脈血栓形成的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年9月至2016年8月我院收治的171例下肢深靜脈血栓形成患者為病例組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合2012年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)周?chē)懿?zhuān)業(yè)委員會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔4〕；②入院前未接受過(guò)抗凝等藥物治療者；③入院前未服用過(guò)可能影響血液成分的藥物；④近2 w內(nèi)未發(fā)生過(guò)活動(dòng)性出血。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期及哺乳期婦女；②心臟功能不全者；③肝、腎功能障礙者；④自身免疫性疾病等炎癥反應(yīng)性疾病者；⑤合并有其他慢性疾病如高血壓、糖尿病者；⑥惡性腫瘤者。其中男95例，女76例；年齡44～75〔平均(53.67±7.82)〕歲。于同期隨機(jī)選取60例無(wú)血管相關(guān)疾病的住院患者為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者未服用過(guò)可能影響血液成分的藥物；②既往無(wú)靜脈血栓病史及其他血液系統(tǒng)疾??；③無(wú)凝血功能障礙者；④無(wú)心、肝、腎功能不全者；⑤無(wú)外周血管病及腦血管病者；⑥無(wú)其他可能影響本研究結(jié)果的疾病如急、慢性感染等。其中男34例，女26例；年齡38～76〔平均(51.08±8.91)〕歲。兩組性別構(gòu)成比、年齡比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 貝克曼-ELITE-ESP型流式細(xì)胞儀、2%多聚甲醛、D-D試劑盒(上海瑞齊生物科技有限公司)。藻紅蛋白標(biāo)志物的抗CD62P、CD63-PE、美國(guó)RB Human PAF ELISA(血清)試劑盒，同型對(duì)照羊抗體LgG1-PE(美國(guó)BD公司)，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗CD61抗體(CD61-FITC)。

1.2.2 標(biāo)本采集 病例組患者入院后給予常規(guī)治療，并于治療前、治療后7 d清晨空腹收集肘靜脈血6 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，對(duì)照組在入院后清晨抽取空腹靜脈血6 ml于抗凝管，并且監(jiān)測(cè)患者髕骨上15 cm和髕骨下10 cm處的周徑進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算周徑差。

1.2.3 測(cè)定方法 ①將其中2 ml經(jīng)EDTA抗凝處理的血液標(biāo)本1 200 r/min離心5 min，并留取含血小板的血漿，同時(shí)保留血清置于-70℃環(huán)境下保存，留待檢測(cè)PAF。取3只分別加入10 μl 的CD61-FITC試管，然后分別加入10 μl的 LgG1-PE、CD62P-PE、CD63-PE，再在3只試管中加入抗凝全血10 μl富含血小板的血漿以及80 μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)液，在室溫環(huán)境中避光孵育30 min，再加入含2%多聚甲醛的PBS 500 μl。通過(guò)陰性對(duì)照管調(diào)整電壓后檢測(cè)測(cè)定管，測(cè)到CD62P-PE、CD63-PE，以CD62設(shè)門(mén)分析CD61門(mén)中CD62P、CD63的陽(yáng)性率，同時(shí)分析活化的血小板，CD62P陽(yáng)性率=(CD61門(mén)中標(biāo)記上CD62P血小板/CD61門(mén)中全部血小板)×100%，CD63陽(yáng)性率=(CD61門(mén)中標(biāo)記上CD63血小板/CD61門(mén)中全部血小板)×100%。②同時(shí)取2 ml經(jīng)EDTA抗凝處理的血液標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定D-D水平，嚴(yán)格按照試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行相關(guān)操作。③取2 ml經(jīng)EDTA抗凝處理的血液標(biāo)本經(jīng)1 200 r/min離心5 min，留取上清液檢測(cè)PAF水平，ELISA法檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和Pearson積矩相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者CD62P、CD63陽(yáng)性率及PAF、D-D水平比較 病例組治療前CD62P、CD63陽(yáng)性率及PAF、D-D水平高于對(duì)照組(P<0.05)，治療后7 d均低于治療前且高于對(duì)照組(P<0.05)，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 病例組患者治療前后患肢與健肢周徑差比較 病例組患者治療后7 d膝上15 cm、膝下10 cm患肢與健肢周徑差〔(2.35±0.46)cm、(2.04±0.55)cm〕均小于治療前〔(4.87±0.58)cm、(3.29±0.61)cm;t=44.526、19.902,均P=0.000〕。各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 病例組治療前CD62P、CD63、PAF、D-D與雙下肢周徑差的相關(guān)性 病例組患者治療前CD62P、CD63、PAF、D-D與膝上15 cm患肢、膝下10 cm患肢和健肢周徑差均呈正相關(guān)(r=0.379、0.426、0.418、0.382；r=0.361、0.398、0.402、0.385，均P<0.05)。

表1 兩組CD62P、CD63陽(yáng)性率及PAF、D-D水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與病例組治療前比較：2)P<0.05

3 討 論

下肢深靜脈血栓形成約占周?chē)苄约膊〉?0%，如果在急性期階段不能及時(shí)診斷并給予有效的治療，可引起靜脈血栓后遺癥以及致命性肺栓塞〔5〕。超聲是下肢深靜脈血栓的主要診斷手段，具有靈敏度高、特異性高的特點(diǎn)，診斷符合率可高達(dá)97%，但是，多普勒超聲雖然能診斷下肢深靜脈血栓形成，但是無(wú)法確定血栓情況下機(jī)體是否處在纖溶狀態(tài)，因此不能預(yù)測(cè)下肢深靜脈血栓形成。正常情況下血小板處于靜息狀態(tài)，當(dāng)受到病理性的刺激時(shí)，血小板活化，在血栓形成過(guò)程中，血小板的活化具有重要意義，是血栓前狀態(tài)的重要指標(biāo)〔6〕。在血小板活化過(guò)程中隨著活化血小板的脫顆粒，靜息血小板胞質(zhì)內(nèi)α顆粒膜上的糖蛋白CD62P和溶酶體膜上的CD63與血小板膜融合進(jìn)行標(biāo)記〔7〕。CD62P主要存在于靜息狀態(tài)下血小板的α顆粒膜上，是反映血小板活化的重要標(biāo)志物，當(dāng)血小板出現(xiàn)活化反應(yīng)時(shí)，通過(guò)開(kāi)放的管道系統(tǒng)，血小板內(nèi)的α顆粒與質(zhì)膜融合，從而使血小板質(zhì)膜上的CD62P分子表達(dá)量增加〔8〕，CD63作為結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特的糖蛋白〔4〕。PAF在血小板-中性粒細(xì)胞的活化過(guò)程中有重要作用，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的炎癥因子和血小板聚集誘導(dǎo)劑。PAF與CD62P具有協(xié)同效應(yīng)，兩者在內(nèi)皮細(xì)胞的表面表達(dá)而介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，同時(shí)PAF通過(guò)活化白細(xì)胞而促進(jìn)整合素的表達(dá)，進(jìn)而形成穩(wěn)定的黏附。D-D診斷血栓性疾病具有重要的價(jià)值，是反映機(jī)體內(nèi)血液高凝以及纖溶亢進(jìn)的指標(biāo)〔9〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明下肢深靜脈血栓形成患者體內(nèi)血小板活化反應(yīng)較明顯，血小板活化參與了血栓的形成及發(fā)展過(guò)程，該結(jié)果可在一定程度說(shuō)明CD62P、CD63、PAF、D-D作為下肢深靜脈血栓形成的早期診斷和早期預(yù)測(cè)指標(biāo)具有重要意義。另外常規(guī)的抗凝、溶栓、抗血小板治療能有效改善患者的病情，降低血小板活化程度。研究還提示通過(guò)治療患者仍然存在不同程度的血小板活化，因此對(duì)于接受治療的下肢深靜脈血栓形成患者，應(yīng)考慮增加治療藥物的劑量，治療結(jié)束后仍需要定期隨訪(fǎng)。此外，經(jīng)治療后，患者的血栓有一定程度的改善。而且CD62P、CD63、PAF、D-D與雙下肢周徑差的變化情況一致，因此推斷上述指標(biāo)可作為早期診斷和早期預(yù)測(cè)下肢深靜脈血栓形成的重要指標(biāo)。

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〔2016-06-27修回〕

(編輯 滕欣航)

劉建龍(1966-)，男，主任醫(yī)師，主要從事外周血管疾病研究。

張?zhí)N鑫(1987-)，男，博士，醫(yī)師，主要從事外周血管疾病研究。

R6

A

1005-9202(2017)05-1221-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.086