高靜媛 楊雨旸 邢 磊 梁芳倩 于曉龍

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

DHPLC法分析視黃醇結(jié)合蛋白4基因rs17484721及rs36035572多態(tài)性與老年人超重肥胖的關(guān)系

高靜媛 楊雨旸 邢 磊 梁芳倩 于曉龍

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

目的 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-變性高效液相色譜(DHPLC)法對老年人群視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)4基因的rs17484721和rs36035572位點進(jìn)行篩查，并分析各基因型之間肥胖、胰島素及血脂的差異。方法 選擇健康查體的漢族老年人304例。檢測空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS),計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。采用DHPLC技術(shù)篩查RBP4基因rs17484721和rs36035572多態(tài)性位點,測序分析結(jié)果。結(jié)果 兩個位點的突變存在強(qiáng)連鎖不平衡。TT-II組體重指數(shù)(BMI)、腰臀比明顯高于TC-ID+CC-DD組，考慮TT-II基因型的人群出現(xiàn)向心性肥胖的概率較大。結(jié)論 RBP4基因多態(tài)性可能與老年人超重肥胖相關(guān)。

視黃醇結(jié)合蛋白4基因；多態(tài)性；超重肥胖；向心性肥胖；胰島素抵抗

視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)4基因位于10q23-24,此部位位于CYP2C基因簇中心，有研究顯示該區(qū)域與2型糖尿病(T2DM)相關(guān)〔1〕。人RBP4 基因約10 kb,含6 個外顯子和5 個內(nèi)含子,外顯子較短,內(nèi)含子大小變化很大，非編碼區(qū)SNP位點可增加糖尿病的易感性，與肥胖、胰島素抵抗及胰島素分泌相關(guān)。老年人多存在腹型肥胖及胰島素抵抗，目前尚無老年人肥胖與RBP4基因多態(tài)性關(guān)系的研究報道。本研究采用變性高效液相色譜(DHPLC)法對RBP4基因rs17484721和rs36035572多態(tài)性位點進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取門診健康查體老年人304例，男157例，女147例，平均年齡65歲，排除嚴(yán)重心肝腎疾病，排除糖尿病、高血壓及冠心病。樣本采集遵循“知情同意”原則。

1.2 環(huán)境危險因素的流行病學(xué)調(diào)查及臨床生化指標(biāo)檢測 采用問卷調(diào)查的方式，通過面對面詢問，按照統(tǒng)一測量標(biāo)準(zhǔn),對所有研究對象分別測量身高、體重、腹圍、臀圍和血壓等，抽取空腹靜脈血，測定空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、RBP4水平及血清胰島素(FINS)，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及腰臀比(WHR)。

1.3 分子生物學(xué)實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取 參照文獻(xiàn)〔2〕介紹的方法進(jìn)行。常規(guī)抽取研究對象靜脈血5 ml，EDTA抗凝,低滲法分離白細(xì)胞，SDS-蛋白酶K消化，用苯酚-氯仿法提取白細(xì)胞DNA后，溶于TE緩沖液，置-20℃冰箱保存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 參照GenBank中NT_030059序列自行設(shè)計PCR引物，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min后，95℃30 s,56℃40 s,72℃40 s，共完成30個循環(huán)，72℃延伸7 min。產(chǎn)物加載樣緩沖液經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml EB)60 V恒壓電泳30 min，紫外透射儀觀察結(jié)果后，置冰箱4℃保存。

1.3.3 DHPLC分析 參照J(rèn)ones等〔3〕方法，將PCR產(chǎn)物95℃變性5 min后，以-1℃/s的速度緩慢復(fù)性至45℃。置Wavetm核苷酸片段分析系統(tǒng)(美國Transgenomic技術(shù)有限公司)96孔板上，輸入DNA序列，根據(jù)序列用Wavemaker4.0軟件選擇樣品最佳運行溫度(60.5℃)和起始洗脫梯度后，自動進(jìn)樣5 μl PCR產(chǎn)物，于DNASep分離柱(Transgenomic產(chǎn)品)用緩沖液A、緩沖液B梯度洗脫，起始梯度為58%B，以每分鐘增加1.8%B的速率線性洗脫4 min，流速為0.9 ml/min，從分離柱洗脫的DNA溶液用紫外檢測儀檢測OD260 nm波長處吸收峰。

1.3.4 DNA序列分析 對DHPLC分析有異常峰型的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行核苷酸序列測定(上海生工測序部)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行χ2檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 DHPLC篩查結(jié)果 第一次DHPLC篩查后為單峰，混后DHPLC色譜圖為雙峰者為兩位點發(fā)生了純合突變，見圖1。本實驗篩選了304例受試者血樣，rs17484721位點有T、C兩種等位基因，TT、TC、CC三種基因型。rs36035572有I、D兩種等位基因，II、ID、DD三種基因型。共獲3種不同類型DHPLC色譜圖(圖1)分別代表三種基因型，即TT-II、TC-ID、CC-DD。其中發(fā)現(xiàn)93例為雜和型(TC-ID)；6例為純合型(CC-DD)；205例為

野生型(TT-II)。

2.2 不同基因型檢測指標(biāo)比較 所有基因型分為兩組即TT-II組及TC-ID+CC-DD組，TT-II組BMI及WHR明顯高于TC-ID+CC-DD組(P<0.05)，其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

a雜和突變攜帶者色譜圖；b無突變者色譜圖；c純和突變攜帶者色譜圖(第一次篩選為單峰，第二次混合后是雙峰) 圖1 DHPLC檢測PCR產(chǎn)物的部分結(jié)果表1 老年人群RBP4基因的rs17484721和rs36035572位點不同基因型的檢測指標(biāo)比較

組別nBMI(kg/m2)WHRFPG(mmol/L)FINS(mU/L)HOMA-IRTT-II組20525.88±3.910.88±0.084.76±0.6816.71±18.212.57±2.28TC-ID+CC-DD組9922.76±3.431)0.82±0.072)4.61±0.7012.09±9.712.08±2.07組別nTC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)RBP4(mg/L)TT-II組2054.78±1.151.76±0.560.85±0.161.88±0.5918.31±1.14TC-ID+CC-DD組994.58±1.191.67±0.490.90±0.241.85±0.6419.03±1.39

與TT-II組比較：1)P=0.007；2)P=0.031

3 討 論

迄今國外文獻(xiàn)報道已在白種人、蒙古等人群中發(fā)現(xiàn)10余種RBP4 基因的突變位點〔4，5〕,這些突變對基因功能的影響各不同，與T2DM、胰島素抵抗的相關(guān)性不一。Munkhtulga等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)日本人、蒙古人中RBP4的基因表達(dá)與脂肪因子及BMI密切相關(guān)。Kovacs等〔7〕發(fā)現(xiàn)德國健康白人血漿中的FFA濃度與SNP rs3758539,G>A密切相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)TT-II基因型老年人群BMI及WHR明顯高于TC-ID+CC-DD組。推測TT-II基因型可能與老年人腹型肥胖密切相關(guān)。本研究并未發(fā)現(xiàn)TT-II，TC-ID+CC-DD組之間血清RBP4水平有明顯差異，考慮基因位點的突變沒有影響蛋白的轉(zhuǎn)錄，推測這種肥胖的遺傳傾向與蛋白功能無明顯相關(guān)性。當(dāng)然除了基因因素外，影響肥胖的因素很多，我們應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本和增加不同種族，提供更多證據(jù)，支持這一結(jié)論。

1 Kovacs P,Geyer M,Berndt J,etal.Effects of genetic variation in the human retinol binding protein-4 Gene (RBP4) on insulin resistance and fat depot specific mRNA expression〔J〕.Diabetes,2007;56：3095-100.

2 Dong M,Gong YH,Wang L,etal.Application of DNA extraction and analysis of its influence factors〔J〕.Hereditas,2003;25(2):205-7.

3 Jones AC,Austin J,Hansen N,etal.Optimal temperature selection for mutation detection by denaturing HPLC and comparison to single-stranded conformation polymorphism and heteroduplex analysis〔J〕.Clin Chem,1999;45 (8 Pt 1):1133-40.

4 Takebayashi K,Suetsugu M,Wakabayashi S,etal.Retinol binding protein-4 levels and clinical features of type 2 diabetes patients〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2007;92(7):2712-9.

5 Ost A,Danielsson A,Lidén M,etal.Retinol-binding protein-4 attenuates insulin-induced phosphorylation of IRS1 and ERK1/2 in primary human adipocytes〔J〕.FASEB J,2007;15.

6 Munkhtulga L,Nakayama K,Utsumi N,etal.Identification of a regulatory SNP in there retinol binding protein 4 gene associated with type 2 diabetes in Mongolia〔J〕.Hum Genet,2007;120(6):879-88.

7 Kovacs P,Geyer M,Bemdt J,etal.Effects of genetic variation in the human retinol binding protein 4 gene(RBP4)on insulin resistance and fat dep-ot specific mRNA expression〔J〕.Diabetes,2007;56(12):3095-100.

〔2015-11-14修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(No.20120414)

楊雨旸(1979-)，男，碩士，講師，主要從事糖尿病并發(fā)癥研究。

高靜媛(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病易感基因研究。

R589.1

A

1005-9202(2017)05-1115-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.033