劉向榮 李明華 樸春麗 米 佳 劉揚(yáng)揚(yáng)

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130021)

16SrRNA基因檢測(cè)在老年糖尿病燒傷膿毒血癥診治中的價(jià)值

劉向榮 李明華1樸春麗2米 佳2劉揚(yáng)揚(yáng)2

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 探討16S核糖體RNA(16SrRNA)基因檢測(cè)對(duì)于老年糖尿病患者燒傷膿毒血癥耐藥性檢測(cè)的臨床價(jià)值。方法 收集老年糖尿病燒傷患者可疑膿毒血癥患者41例外周靜脈血標(biāo)本共45份，將每份標(biāo)本分別進(jìn)行血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素(IL)-6、-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血液培養(yǎng)以及16SrRNA基因檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌病原體檢測(cè)的陽(yáng)性率，以PCR及血培養(yǎng)陰性、陽(yáng)性患者血常規(guī)、TNF-α、IL-6 、CRP、FPG、餐后2 h血糖(2 h PG)、HbA1c的相關(guān)性。結(jié)果 采用PCR和血培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率和操作時(shí)間，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。16SrRNA基因檢測(cè)及血培養(yǎng)方法陽(yáng)性及陰性標(biāo)本患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、CRP、IL-6、TNF-α水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且陽(yáng)性患者明顯高于陰性患者，16SrRNA基因檢測(cè)及血培養(yǎng)方法陽(yáng)性及陰性標(biāo)本患者FPG、2 h PG比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但HbA1c組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩種檢測(cè)方法分離病原菌以革蘭陰性菌為主，革蘭陽(yáng)性菌低于革蘭陰性菌，但是行血培養(yǎng)陰性患者中有部分患者PCR檢測(cè)陽(yáng)性。結(jié)論 老年糖尿病燒傷患者應(yīng)早期行血常規(guī)、TNF-α、IL-6 、CRP檢測(cè)、監(jiān)測(cè)FPG、2 h PG變化，一旦有潛在膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)，行16SrRNA基因PCR檢測(cè)，判斷細(xì)菌特征，早期給予抗感染對(duì)癥治療。16SrRNA基因PCR檢測(cè)應(yīng)用于老年糖尿病燒傷膿毒癥患者細(xì)菌感染特異性、快速性、敏感性均較高，操作時(shí)間短，不受臨床應(yīng)用抗生素的影響。

16SrRNA；糖尿病；燒傷

糖尿病合并燒傷患者由于代謝紊亂，往往出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)障礙、組織修復(fù)及抵抗力降低,糖尿病與燒傷感染二者互為因果，使得老年糖尿病患者合并大面積燒傷后極易發(fā)生創(chuàng)面膿毒癥，成為提高燒傷救治成功率的一大障礙〔1〕。目前血培養(yǎng)陽(yáng)性與臨床表現(xiàn)不同步，不能作出及時(shí)診斷。臨床多經(jīng)驗(yàn)性采取相對(duì)應(yīng)的抗菌藥物，待血培養(yǎng)結(jié)果回報(bào)后對(duì)臨床用藥才起到指導(dǎo)作用〔2〕,16S核糖體RNA(16SrRNA)PCR檢測(cè)細(xì)菌感染為感染性疾病快速診斷提供一個(gè)新方法〔3〕。本研究擬分析16SrRNA基因檢測(cè)老年糖尿病患者燒傷膿毒血癥的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年1月至2015年1月于燒傷科住院治療的可疑膿毒癥患者41 例,共取得標(biāo)本45份。其中男35例，女6例，年齡62～80，平均(71.2±4.1)歲，體重(65.2±12.2)kg，火焰燒傷23例，熱蒸汽燒傷18例。燒傷面積30%～68%,平均燒傷面積為(46.1±3.6)%，燒傷深度均達(dá)到Ⅱ°～Ⅲ°。選取病例標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)制定的燒傷膿毒癥臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：高度懷疑細(xì)菌感染且符合下述前4條中2條以上,且合并有第5條中的任何1項(xiàng)〔4〕： ①體溫>39℃或<35.5℃,持續(xù)時(shí)間超過(guò)3 d。②心率>120次/min。③白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)>12.0×109/L 或<4.0×109/L,其中中性粒細(xì)胞比例超過(guò)80%或幼稚粒細(xì)胞超過(guò)10%。④呼吸頻率>28次/min。⑤出現(xiàn)下列臨床癥狀的一種：焦慮抑郁；煩躁、譫語(yǔ)；腹脹、腹瀉；消化道出血。在抽取血液標(biāo)本前所有患者均已使用3 d以上的抗生素。

1.2 標(biāo)本處理 常規(guī)抽取入選患者外周靜脈血，送檢驗(yàn)科行血培養(yǎng)，檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、血常規(guī)、空腹血糖、餐后2 h血糖(2 h PG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)，抽取6份健康人群的血液標(biāo)本中，吸取200 μl注入1.5 ml無(wú)菌離心管中,然后每管中放入銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落,形成細(xì)菌感染的血標(biāo)本模擬組作為陽(yáng)性對(duì)照。另從此6份健康人的血標(biāo)本中各吸取200 μl分別注入1.5 ml無(wú)菌離心管中,作為陰性對(duì)照。將其置于-20℃冰箱中備用。

檢查方法:選擇酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)CRP、IL-6、IL-10、TNF-α(試劑盒購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司)，所有檢測(cè)操作過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

將本實(shí)驗(yàn)中的45份實(shí)驗(yàn)標(biāo)本分3批次再進(jìn)行細(xì)菌DNA提取、PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳,每批15份。陰、陽(yáng)性對(duì)照組共 12 份標(biāo)本為一批，細(xì)菌 DNA提取及PCR檢測(cè)參照具體的試劑盒操作步驟說(shuō)明進(jìn)行。16SrRNA細(xì)菌通用引物上游引物:5′TTGGAGAGTTTGATCCTGGGCTC3′,在大腸桿菌基因上位置4～25;下游引物:5′ACGTCATCCCCACCTTCCTC3′,在大腸桿菌基因上位置1 174～1 194。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率比較 采用PCR方法檢測(cè)后19例PCR產(chǎn)物出現(xiàn)1.2 kb長(zhǎng)度的條帶，為細(xì)菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率為42.22%，血培養(yǎng)中細(xì)菌陽(yáng)性11例(24.44%)，其中9例血培養(yǎng)陽(yáng)性患者的PCR檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性，另2例PCR檢測(cè)為陰性，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PCR檢測(cè)的操作時(shí)間〔(4.1±1.1)h〕短于血培養(yǎng)〔(26.5±11.7)h〕(P<0.05)。

2.2 PCR及血培養(yǎng)陰性、陽(yáng)性患者TNF-α、IL-6 、CRP以及血糖水平比較 PCR及血培養(yǎng)陽(yáng)性、陰性患者WBC、TNF-α、IL-6、CRP以及FPG、2 h PG水平差異顯著(P<0.05)；PCR及血培養(yǎng)陽(yáng)性患者WBC、TNF-α、IL-6、CRP水平高于陰性患者。兩組HbA1c水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PCR及血培養(yǎng)陽(yáng)性患者FPG、2 h PG水平高于陰性患者(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 PCR及血培養(yǎng)陰性、陽(yáng)性患者TNF-α、IL-6 、CRP以及血糖水平比較

與PCR陽(yáng)性比較：1)P<0.05;與血培養(yǎng)陽(yáng)性比較:2)P<0.05

2.3 燒傷患者PCR及血培養(yǎng)兩種檢測(cè)方法分離病原菌的比較 PCR檢測(cè)陽(yáng)性19例患者中革蘭陽(yáng)性菌6例(31.58%)，其中凝固酶陰性葡萄球菌2例(10.53%)，金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、尿腸球菌均1例(5.26%)；革蘭陰性菌13例(68.42%)，其中銅綠假單胞菌6例(31.58%)，大腸埃希菌、陰溝桿菌、肺炎克雷菌均2例(10.53%)，鮑氏不動(dòng)桿菌1例(5.26%)。血培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性11例患者中革蘭陽(yáng)性菌3例(27.27%)，其中凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌均1例(9.09%)；革蘭陰性菌8例(72.73%)，其中銅綠假單胞菌4例(36.36%)，大腸埃希菌2例(18.18%)，陰溝桿菌和鮑氏不動(dòng)桿菌均1例(9.09%)。

3 討 論

目前我國(guó)老年糖尿病的患病率為 10%～20%〔5〕。老年糖尿病患者由于病程長(zhǎng)、體質(zhì)弱、免疫功能差、血糖控制不良等原因，一旦發(fā)生燙傷，開(kāi)放性的燒傷創(chuàng)面，發(fā)熱、高血糖、大量滲出給細(xì)菌、真菌的定植提供了良好的環(huán)境?；颊呓M織器官出現(xiàn)水電解質(zhì)紊亂，免疫功能在燒傷發(fā)生后2 w處于較低水平，受損傷的心肺功能、腎功能不能得到恢復(fù)，創(chuàng)面發(fā)生感染，容易發(fā)生膿毒癥。膿毒癥是因感染而導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，是燒傷常見(jiàn)并發(fā)癥。傳統(tǒng)的體溫、WBC等檢測(cè)方法難以將其鑒別開(kāi)來(lái)。引起燒傷膿毒癥的病原體主要有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等。以往燒傷科醫(yī)師通常早期應(yīng)用革蘭陽(yáng)性球菌藥物，中期創(chuàng)面以革蘭陰性桿菌為主，應(yīng)用革蘭陰性桿菌藥物或廣譜抗菌藥物聯(lián)合用藥，以達(dá)到控制創(chuàng)面感染增強(qiáng)療效，預(yù)防和控制膿毒癥的發(fā)生。但是老年糖尿病患者合并大面積燒傷，身體功能差，膿毒癥的發(fā)生出現(xiàn)較早，燒傷后患者在應(yīng)激狀態(tài)下，胰高血糖素分泌升高，而胰島素分泌下降，導(dǎo)致血糖升高。大量滲出物為細(xì)菌侵襲、生長(zhǎng)提供良好培養(yǎng)基，可加重?zé)齻∏?甚至導(dǎo)致死亡。而燒傷常伴的并發(fā)癥,如疼痛、毒素吸收、代謝改變及創(chuàng)面感染等，也均能加重糖尿病的病情。臨床上選用病原菌敏感的抗菌藥物是控制病情發(fā)展、降低病死率的關(guān)鍵。

16SrRNA是細(xì)菌體內(nèi)存在特有的rRNA，大約2.9 kb，比真核生物的相應(yīng)rRNA略小，具有較高保守性,不同種屬之間的細(xì)菌16SrRNA基因同源性高達(dá)97%〔6〕，是原核微生物的標(biāo)志性基因。通過(guò)16SrRNA的基因PCR 擴(kuò)增,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，便能夠?qū)?xì)菌感染的存在進(jìn)行早期判斷。傳統(tǒng)對(duì)病原菌的分類鑒定主要采用細(xì)菌培養(yǎng)，血培養(yǎng)需要分離培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定，步驟多，操作復(fù)雜，受外界和人為影響大，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且無(wú)法達(dá)到較高的陽(yáng)性率，此外有些細(xì)菌常無(wú)法得出結(jié)果〔7〕,一旦臨床應(yīng)用抗生素后敏感性低，結(jié)果滯后于臨床的需求，在臨床上的使用受到了較大的限制。

本研究發(fā)現(xiàn)16SrRNA基因PCR檢測(cè)對(duì)微生物的分離培養(yǎng)不依賴，不受抗菌藥物的影響，能夠鑒定出死菌和目前人工無(wú)法培養(yǎng)的微生物，可以發(fā)現(xiàn)微生物新種類。已作為快速診斷某些感染性疾病的“金標(biāo)準(zhǔn)”〔8〕。

由于革蘭陽(yáng)性球菌和革蘭陰性桿菌均能引起膿毒血癥，應(yīng)用廣譜抗菌藥物或聯(lián)合用藥后容易出現(xiàn)多種藥物耐藥，由于針對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌和革蘭陰性桿菌抗菌藥物不同，應(yīng)對(duì)細(xì)菌作出早期判斷。本研究顯示PCR的陽(yáng)性率明顯高于血培養(yǎng)方法的陽(yáng)性率。革蘭陽(yáng)性菌中葡萄球菌比例較高，這可能是因?yàn)槔夏晏悄虿』颊邿齻?，血糖升高自身抵抗力較差，葡萄球菌大量繁殖，引起感染加重。革蘭陰性菌中銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、陰溝桿菌為主，說(shuō)明老年糖尿病患者燒傷后，血糖升高自身抵抗力較差，條件治病菌大量繁殖，引起感染加重導(dǎo)致膿毒血癥的發(fā)生為細(xì)菌陽(yáng)性。本研究說(shuō)明PCR檢測(cè)技術(shù)的敏感性較高。這可能是由于PCR高擴(kuò)增效率，PCR技術(shù)不但能檢測(cè)到擴(kuò)增的活細(xì)菌,還能檢測(cè)到擴(kuò)增的被抗生素殺死而DNA未被遭破壞細(xì)菌，但是血培養(yǎng)僅對(duì)于活細(xì)菌有效。該方法適用于銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的快速鑒定〔9〕，由于16SrRNA基因存在于所有細(xì)菌及部分原核生物的染色體基因中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物體內(nèi)。故本研究對(duì)真菌的檢測(cè)出現(xiàn)盲區(qū)，還需要血培養(yǎng)的檢測(cè)。另外，對(duì)大腸埃希菌卻不完全適用。

TNF-α、IL-6是體內(nèi)重要的炎癥因子， CRP 是機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)時(shí)合成的急性期反應(yīng)蛋白，在機(jī)體對(duì)炎癥、組織損傷、感染等反應(yīng)中起著重要作用。HbA1c反映患者近8～12 w的血糖控制情況，不受抽血時(shí)間、是否空腹、是否使用胰島素等因素干擾。FPG和2 h PG是反映燒傷后出現(xiàn)感染前后的血糖水平，本研究結(jié)果提示在臨床工作中一旦發(fā)現(xiàn)患者FPG和HbA1c升高異常，就要注意膿毒血癥的發(fā)生。

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〔2016-11-09修回〕

(編輯 滕欣航)

吉林省衛(wèi)生計(jì)生委課題(20152C027)

樸春麗(1964-)，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥研究。

劉向榮(1990-)，女，在讀博士，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)05-1113-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.032

1 吉林省人民醫(yī)院燒傷科

2 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科