龍 進(jìn)

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530000)

黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制

龍 進(jìn)

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530000)

目的 探討黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞株增殖的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。方法 將濃度為0、25、50、100、200、400 μmol/L的黃芩苷作用于經(jīng)體外培養(yǎng)的A549人肺腺癌細(xì)胞株24、48、72 h，采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的抑制率；收集30 μmol/L黃芩苷孵育24 h后的A549肺腺癌細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及 p21 mRNA的表達(dá)水平，采用Western印跡法檢測(cè)CyclinD1、PCNA及p21蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 不同濃度的黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的增殖均具有不同程度的抑制作用，并且呈劑量效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。30 μmol/L黃芩苷(實(shí)驗(yàn)組)作用于A459肺腺癌細(xì)胞24 h后，CyclinD1、PCNA及其蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，p21及其蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 通過(guò)抑制CyclinD1、PCNA的表達(dá)以及促進(jìn)p21的表達(dá)，黃芩苷抑制A549肺腺癌細(xì)胞增殖。

黃芩苷；A549肺腺癌細(xì)胞；增殖；抑制

肺腺癌是肺癌常見(jiàn)的病理類(lèi)型，具有易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì)放射治療反應(yīng)不佳以及對(duì)化療藥物存在明顯的局限性等特點(diǎn)〔1〕。黃芩苷是從唇形科植物黃芩中提取分離得到的具有抗氧化、誘導(dǎo)干細(xì)胞分化等多種藥理作用的黃酮類(lèi)化合物〔2〕。報(bào)道顯示，黃芩苷具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡等作用〔3〕，目前對(duì)黃芩苷的抗腫瘤機(jī)制的研究主要集中在肝細(xì)胞癌、膀胱癌以及結(jié)腸癌等惡性腫瘤〔4～6〕。關(guān)于黃芩苷對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖抑制的研究相對(duì)較少，本研究旨在探討黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 A549肺腺癌細(xì)胞株(由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供)，純度為99.1%的黃芩苷(南京青澤醫(yī)藥公司提供)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司提供)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、p21等相關(guān)的一抗(美國(guó)Santa Cruz公司提供)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(大連寶生物技術(shù)公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549肺腺癌細(xì)胞株培養(yǎng)在內(nèi)含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，2～3 d更換1次培養(yǎng)液，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 采用0.25%的胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺腺癌細(xì)胞，將其細(xì)胞密度調(diào)整為1×107/L，然后接種到96孔板內(nèi)，將濃度分別為0、25、50、100、200、400 μmol/L的黃芩苷加入其中孵育24、48、72 h，在培養(yǎng)終止前每孔加入終質(zhì)量濃度為0.5 g/L的MTT繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，將100 μl的二甲基亞砜加入其中振蕩以充分溶解，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm時(shí)的吸光度(A)值并計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%，其中實(shí)驗(yàn)組為30 μmol/L的黃芩苷，對(duì)照組為0 μmol/L的黃芩苷。每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算10%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制時(shí)的藥物濃度(IC10)和50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制時(shí)的藥物濃度(IC50)半數(shù)抑制濃度。

1.2.3 RT-PCR法測(cè)定CyclinD1、PCNA及p21 mRNA表達(dá)情況 將濃度為30 μmol/L的黃芩苷加入到A549肺腺癌細(xì)胞中孵育24 h，收集細(xì)胞并提取細(xì)胞中的RNA，在95℃下5 min預(yù)變性，95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒上的說(shuō)明實(shí)施反轉(zhuǎn)錄以及目的片段的擴(kuò)增。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離并掃描成像，采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析。以未做任何處理的A549肺腺癌細(xì)胞株為對(duì)照組，GAPDH為內(nèi)參照。以下為引物的序列：CyclinD1的上游引物序列為，下游引物序列為，擴(kuò)增的產(chǎn)物是386 bp；PCNA的上游引物序列為，下游引物序列為，擴(kuò)增的產(chǎn)物是369 bp；p21的上游引物序列為，下游引物序列為，擴(kuò)增的產(chǎn)物是427 bp；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為，下游引物序列為，擴(kuò)增的產(chǎn)物是452 bp。

1.2.4 Western印跡法測(cè)定CyclinD1、PCNA及p21蛋白表達(dá)情況 采用Bradford法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白的濃度，再分別采集40 μg各例蛋白樣本以10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜用5%的脫脂奶粉在室溫環(huán)境下封閉60 min，將1∶400稀釋過(guò)的一抗加入其中，在4℃環(huán)境下孵育24 h，將二抗加入其中孵育90 min后漂洗，以化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，內(nèi)參照為GAPDH。BioRad圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的A值進(jìn)行測(cè)定，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白A值/內(nèi)參照蛋白蛋白A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的增殖均具有不同程度的抑制作用，并且呈劑量效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系(見(jiàn)圖1)；黃芩苷作用于A549肺腺癌細(xì)胞24、48、72 h的IC10分別為31、26、23 μmol/L。IC50分別為225、183、126 μmol/L，細(xì)胞抑制率≤10%是黃芩苷的非細(xì)胞毒性濃度，本研究選擇30 μmol/L作用時(shí)間24 h為實(shí)驗(yàn)室的安全劑量。

2.2 黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞CyclinD1、PCNA及p21 mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)組CyclinD1、PCNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組，p21的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 兩組A549肺腺癌細(xì)胞CyclinD1、PCNA及p21蛋白水平比較 實(shí)驗(yàn)組CyclinD1蛋白、PCNA蛋白水平低于對(duì)照組，p21蛋白水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用表1 黃芩苷對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞CyclinD1、PCNA及 p21 mRNA表達(dá)的影響

表2 比較兩組A549肺腺癌細(xì)胞CyclinD1、PCNA及 p21蛋白水平

3 討 論

目前臨床主要采取放化療治療肺腺癌，以提高惡性腫瘤患者的生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存時(shí)間，但報(bào)道顯示，化療藥物對(duì)患者存在不同程度的不良反應(yīng)〔7〕。從天然植物中提取、分離抗腫瘤藥物成為目前抗腫瘤新藥研發(fā)的熱點(diǎn)，《神農(nóng)本草經(jīng)》載有黃芩具有瀉火解毒、清熱燥濕以及止血等功效，而現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芩有抗病毒、抗過(guò)敏、抗氧化以及抗腫瘤的作用〔8〕。黃芩苷是從中藥黃芩中提取、分離而來(lái)的黃酮類(lèi)化合物，它可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡以及抗新生血管生成〔9,10〕。本研究結(jié)果提示黃芩苷具有明顯的抗肺腺癌效果，與有關(guān)研究結(jié)果一致〔11〕。肺腺癌的發(fā)病機(jī)制主要與腫瘤的細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度的增殖、生長(zhǎng)有關(guān)，CyclinD1通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK)4結(jié)合而啟動(dòng)DNA的復(fù)制，以使細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期來(lái)參與細(xì)胞周期的過(guò)程〔12〕，PCNA作為DNA聚合酶的附屬蛋白，可以反映細(xì)胞增殖率以及DNA的合成率，其水平越高，提示細(xì)胞增殖效果越強(qiáng)〔13〕，p21蛋白屬于細(xì)胞周期抑制蛋白，具有最廣泛的激酶抑制活性，它通過(guò)使Cyclin-CDK復(fù)合物的激酶活性喪失而參與腫瘤細(xì)胞的增值過(guò)程〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明黃芩苷通過(guò)下調(diào)CyclinD1、PCNA，上調(diào)p21水平而在抑制A549肺腺癌細(xì)胞增殖方面發(fā)揮作用，推測(cè)可能是因?yàn)辄S芩苷通過(guò)多個(gè)途徑，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制新生血管的生成等達(dá)到抗腫瘤的目的〔15〕。

1 Masri S,Papagiannakopoulos T,Kinouchi K,etal.Lung adenocarcinoma distally rewires hepatic circadian homeostasis〔J〕.Cell,2016;165(4):896-909.

2 韋小白,董競(jìng)成.黃芩苷對(duì)人肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究〔J〕.世界中醫(yī)藥,2014;9(2):213-7.

3 Wang XF,Zhou QM,Du J,etal.Baicalin suppresses migration,invasion and metastasis of breast cancer via p38MAPK signaling pathway〔J〕.Anticancer Agents Med Chem,2013;13(6):923-31.

4 Yin H,Bhattarai JP,Oh SM,etal.Baicalin activates glycine and〔Formula:see text〕-aminobutyric acid receptors on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subsnucleus caudalis in juvenile mice〔J〕.Am J Chin Med,2016;44(2):389-400.

5 Lin C,Tsai SC,Tseng MT,etal.AKT serine/threonine protein kinase modulates baicalin-triggered autophagy in human bladder cancer T24 cells〔J〕.Int J Oncol,2013;42(3):993-1000.

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〔2016-06-16修回〕

(編輯 滕欣航)

龍 進(jìn)(1964-)，男，碩士，副主任藥師，主要從事中草藥鑒定、分離、含測(cè)及醫(yī)院藥學(xué)的研究。

R73

A

1005-9202(2017)05-1094-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.024