唐 芳 高品操 潘同斌

(湖南醫(yī)藥學院體育教研室，湖南 懷化 418000)

鈍挫傷對大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞體外增殖的影響

唐 芳 高品操 潘同斌1

(湖南醫(yī)藥學院體育教研室，湖南 懷化 418000)

目的 研究鈍挫傷對大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞體外增殖的影響。方法 選取24只5周齡Wistar雄性大鼠，隨機分為安靜對照組(C組)和鈍挫傷即刻(D0組)、24 h(D24組)、48 h組(D48組)4組，每組6只。其中鈍挫傷組進行鈍挫傷的操作后，分別于即刻、24、48 h進行麻醉，與對照組一同摘取左側(cè)腓腸肌，立刻進行肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)。另取新生鼠(N組)2只，宰殺后取下左側(cè)腓腸肌，同樣進行肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)。結(jié)果 新生鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖最顯著，在培養(yǎng)第2天便可見少量紡錘形的單核細胞出現(xiàn)；在第3天就大量增殖，當培養(yǎng)5 d后，衛(wèi)星細胞相互融合形成多核的肌管；D0組3 d后可見肌衛(wèi)星細胞，而D24、D48組4 d后可見衛(wèi)星細胞，到第8天時增殖達到高峰，基本布滿大部分培養(yǎng)皿，部分分化融合成肌管，之后增殖速度下降。C組肌衛(wèi)星細胞含量最少，且增殖速度最慢。結(jié)論 鈍挫傷對骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活與增殖具有重要作用，且新生鼠體內(nèi)的肌衛(wèi)星細胞并未處于靜息狀態(tài)。

骨骼??；鈍挫傷；肌衛(wèi)星細胞

挫傷后所造成肌肉組織的血腫機化、瘢痕修復嚴重影響了運動員的運動能力，骨骼肌衛(wèi)星細胞一旦被激活，細胞一極或兩極發(fā)生細胞質(zhì)突起和延伸，并伴隨的有絲分裂活動增多、異染色質(zhì)量降低、質(zhì)核比率增高和細胞內(nèi)細胞器數(shù)目的增加〔1，2〕。肌衛(wèi)星細胞是一種肌源性干細胞，具有一定的自我更新能力，它是成體組織內(nèi)已發(fā)生某種程度定向分化的專能干細胞〔3〕。肌衛(wèi)星細胞可以看作體內(nèi)潛在的生肌細胞庫，當骨骼肌受到創(chuàng)傷或發(fā)生病理時，肌衛(wèi)星細胞可以增殖、分化并遷移至受損肌組織處，彼此相互融合或與原有的肌纖維融合，形成新的肌纖維〔4〕。本文建立鈍挫傷模型，研究大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的體外培養(yǎng)情況，初步探索骨骼肌損傷修復的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗分組與取材 選取24只5周齡清潔級雄性Wistar大鼠與2只新生鼠，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2007-0001。24只Wistar雄性大鼠，隨機平均分為4組。其中三組進行鈍挫傷的操作后，分別于即刻、24、48 h(D0、D24、D48組)進行麻醉，摘取左側(cè)腓腸肌，進行肌衛(wèi)星細胞的體外培養(yǎng)。余下另一組為安靜對照組(C組)大鼠不運動，經(jīng)麻醉后摘取左側(cè)腓腸肌，進行肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)。新生鼠(N組)2只，宰殺后取下左側(cè)腓腸肌，同樣進行肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)。

1.2 鈍挫傷模型 本實驗采用定量負荷自由落體打擊的方法制作骨骼肌鈍挫傷模型。大鼠在動物房適應性飼養(yǎng)3 d，3 d后用2.5%戊巴比妥鈉以2 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉生效后，將左后肢褪毛，并置于伸膝、踝背屈90°、稍外展位固定，使小腿后群肌置于脛、腓骨內(nèi)側(cè)，腓腸肌暴露清楚。參照陳疾忤等人〔5〕的實驗，并在此基礎上自制重物打擊裝置，為一金屬圓柱體，質(zhì)量為200 g，底面面積為2.25 cm2，下降高度為36 cm，動能為0.7 J。用自制重物下砸儀從規(guī)定高處自由垂直落下打擊腓腸肌中段，以2 s的間隔連續(xù)擊打5次，造模后左后肢明顯腫脹，未見瘀血，沒有明顯的跛行，并注意保護大鼠皮膚的完整性避免感染。經(jīng)解剖證實了該肌肉鈍挫傷模型建立的成功率為100%。

1.3 主要儀器與試劑 超凈工作臺(蘇州凈化工作臺)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技)；光學倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；HH.B-TS-A1型恒溫培養(yǎng)箱(長沙醫(yī)療器械)；NikonE600顯微照相圖像采集系統(tǒng)(日本尼康)。新配置的培養(yǎng)基：高糖DMEM培養(yǎng)基(占總量的77%)、胎牛血清(占總量的10%)、馬血清(占總量的10%)、Hanks液(占總量的2%)、青-鏈霉素(占總量的1%)混合制成。

1.4 骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)的分離及培養(yǎng)方法

1.4.1 處理組織 分別將取下的各組織在超凈工作臺中用加有2%雙抗的Hanks液清洗至無血，接著用眼科小剪刀剪成1 mm3大小的肉糜。

1.4.2 清洗組織 用Hanks液將組織清洗3遍，靜置組織沉淀并緩慢倒出洗液。加入0.25%胰蛋白酶靜置組織沉淀并倒掉液體，保留沉淀物。

1.4.3 組織消化 沉淀物中加入約5 ml的0.25%胰蛋白酶，震蕩搖勻迅速倒進離心管后塞住瓶塞，放置37℃水浴中消化60 min左右，此過程每隔10 min吹打1次，反復吹打后并出現(xiàn)大量乳白色懸浮絮狀物，可加入培養(yǎng)液停止消化。

1.4.4 過濾 將消化液在200目的過濾網(wǎng)中進行過濾，過濾后收集濾液置于2 000 r/min離心10 min，棄上清取沉淀。

1.4.5 純化 利用肌衛(wèi)星細胞與成纖維細胞貼壁速度不同，采用連續(xù)差速貼壁法純化肌衛(wèi)星細胞。取沉淀放入培養(yǎng)瓶，加入適量培養(yǎng)液置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，預貼壁30 min。差速貼壁的方式貼壁兩次，每隔1 h貼壁1次。如在CO2恒溫培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，緩慢倒出培養(yǎng)液，保留沉淀物注入新培養(yǎng)液，放置CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置1 h后，繼續(xù)重復注入一次新培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

1.4.6 細胞培養(yǎng) 從靜置的培養(yǎng)瓶中緩慢倒出培養(yǎng)液，保留沉淀物注入新培養(yǎng)液，輕微搖勻后倒入被多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，以后每天換液1次，并用倒置顯微鏡觀察記錄?？梢猿掷m(xù)觀察數(shù)天并注意細菌感染培養(yǎng)的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 各組培養(yǎng)第2天的衛(wèi)星細胞狀況 C組和D0、D24、D48組中未見到肌衛(wèi)星細胞，N組可以看見紡錘形的肌衛(wèi)星細胞。成熟大鼠的正常情況下肌衛(wèi)星細胞處于靜息狀態(tài)，只有在肌肉損傷或者在病理狀態(tài)下才能被激活分化增殖，所以在早期鈍挫傷組以及正常情況下的對照組均未見肌衛(wèi)星細胞。N組處于發(fā)育時期，可見肌衛(wèi)星細胞并仍然保持著特異性成肌細胞的活性。見圖1。

2.2 各組培養(yǎng)第3天的衛(wèi)星細胞狀況 N組肌衛(wèi)星細胞數(shù)量明顯增多，說明新生鼠的肌衛(wèi)星細胞的增殖能力要明顯強于其他組。D0組可見紡錘形的肌衛(wèi)星細胞，但D24、D48組以及C組仍未見到激活的肌衛(wèi)星細胞。D24組、D48組與D0組相比，肌衛(wèi)星細胞還未來得及被激活，可見各組衛(wèi)星細胞被激活時間以及其增殖數(shù)量具有一定差異性。見圖2。

2.3 各組培養(yǎng)第5天的衛(wèi)星細胞狀況 N組與D0組均呈現(xiàn)大量紡錘形的肌衛(wèi)星細胞。D24、D48組以及C組也可見一定數(shù)量的肌衛(wèi)星細胞，并且數(shù)量上較前一天均明顯增多，表明肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)第5天開始大量增殖。見圖3。

2.4 各組培養(yǎng)第8天的衛(wèi)星細胞狀況 各組肌衛(wèi)星細胞數(shù)量均大量增加且分布比較密集，肌管數(shù)量不斷增加，最終排列較之前成熟。其中鈍挫傷組和N組均出現(xiàn)了融合現(xiàn)象，部分并有微管的出現(xiàn)，說明這三組的肌衛(wèi)星細胞已發(fā)生了分化。培養(yǎng)的第8天已進入了增殖分化高峰期，各組中肌衛(wèi)星細胞的密度很大，接下來的培養(yǎng)中肌衛(wèi)星細胞的增殖速度逐漸放緩，沒有明顯的差異。見圖4。

圖1 各組培養(yǎng)第2天的衛(wèi)星細胞狀況(×5)

圖2 各組培養(yǎng)第3天的衛(wèi)星細胞狀況(×5)

圖3 各組培養(yǎng)第5天的衛(wèi)星細胞(×5)

圖4 各組培養(yǎng)第8天的衛(wèi)星細胞狀況(×20)

3 討 論

衛(wèi)星細胞是一群有骨骼肌特異性的、不同種類的干細胞和前體細胞，具有成肌潛能和自我更新能力，在出生后骨骼肌的生長、對運動的適應及損傷修復中起著重要作用〔6，7〕。本文對鈍挫傷后的骨骼肌衛(wèi)星細胞進行體外培養(yǎng)來了解骨骼肌損傷修復的過程以及影響骨骼肌修復的相關因素，并揭示骨骼肌損傷的修復機制，為運動性肌肉損傷的康復提供參考依據(jù)。本研究顯示，鈍挫傷對骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活與增殖具有重要作用，且新生鼠體內(nèi)的肌衛(wèi)星細胞并未處于靜息狀態(tài)。

1 任玉衡,田得祥,史和福,等.優(yōu)秀運動員的運動創(chuàng)傷流行病學調(diào)查〔J〕.中國運動醫(yī)學雜志,2000;19(4):377-86.

2 于新凱,晁唯偉,左 群.運動性骨骼肌損傷超微結(jié)構(gòu)變化的研究進展〔J〕.解剖科學進展,2013;19(3):298-302.

3 Buckingham M,Montarras D.Skeletal muscle stem cells〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2008;18(6):330-6.

4 Adams GR.Satellite cell proliferation and skeletal muscle hypertrophy〔J〕.Appl Physiol Nutr Metab,2006;31(6):782-90.

5 陳疾忤,陳世益,李云霞,等.骨骼肌鈍挫傷后肌電檢測的應用研究〔J〕.中華物理醫(yī)學與康復雜志,2005;27(1):23-5.

6 Le Grand F,Rudnicki MA.Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2007;19(6):628-33.

7 Snijders T,Verdijk LB,Smeets JS,etal.The skeletal muscle satellite cell response to a single bout of resistance type exercise is delayed with aging in men〔J〕.Age(Dordr)，2014;36(4):9699.

〔2015-11-21修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

湖南醫(yī)藥學院校級科研課題(20152KB15)

潘同斌(1965-)，男，教授，碩士生導師，主要從事運動生理與康復研究。

唐 芳(1988-)，女，碩士，主要從事運動保健與瑜伽康復研究。

R873

A

1005-9202(2017)05-1091-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.023

1 揚州大學