彭 靜 陳 曦 王 宇 羅 亮

(樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院康復(fù)基礎(chǔ)教研室，四川 樂山 614000)

以神經(jīng)內(nèi)肽酶為靶點(diǎn)治療阿爾茨海默病的人參皂苷有效組分篩選

彭 靜 陳 曦 王 宇 羅 亮

(樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院康復(fù)基礎(chǔ)教研室，四川 樂山 614000)

目的 探討以神經(jīng)內(nèi)肽酶(NEP)作為靶點(diǎn)治療阿爾茨海默病(AD)的人參皂苷有效組分和篩選方法。方法 構(gòu)建sweAPP-SK細(xì)胞株作為模型細(xì)胞；采用Western印跡及ELISA鑒定構(gòu)建細(xì)胞；采用MTT檢測人參皂苷組分對SK-N-SH細(xì)胞增殖能力的影響；采用NEP肽酶試劑盒測定人參皂苷組分對NEP肽酶活性的影響；采用ELISA檢測篩選有效人參皂苷組分對sweAPP-SK細(xì)胞株的影響。結(jié)果 成功構(gòu)建高表達(dá)APP的sweAPP-SK模型細(xì)胞，sweAPP-SK模型細(xì)胞Aβ40、Aβ42表達(dá)量均較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；人參皂苷組分濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示，各皂苷組分最佳作用濃度分別為皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg2 50 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L，Re 50 μmol/L；人參皂苷組分時(shí)間梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳作用時(shí)間為48～72 h；人參皂苷Rg1、Rg3、Rb1可明顯提高NEP活性，分別為對照組細(xì)胞酶活性的(124±3.6)%、(131±4.1)%和(121±3.2)%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；sweAPP-SK模型細(xì)胞經(jīng)Rg1、Rg3、Rb1作用后，細(xì)胞外Aβ40、Aβ42濃度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 人參皂苷Rg1、Rg3 、Rb1可通過NEP做治療靶點(diǎn)降低sweAPP-SK細(xì)胞株Aβ40、Aβ42的分泌AD的NEP靶點(diǎn)治療提供依據(jù)。

神經(jīng)內(nèi)肽酶；阿爾茨海默病；人參皂苷

β-淀粉樣蛋白(Aβ)在海馬區(qū)的沉積是阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的典型表現(xiàn)，因此，清除或降低Aβ水平是治療AD的目標(biāo)之一。體內(nèi)大部分Aβ通過被中性神經(jīng)內(nèi)肽酶(NEP)為代表的一類蛋白酶降解為小分子后從體內(nèi)清除。另有研究表明，NEP活性降低與腦內(nèi)Aβ水平升高及AD患者認(rèn)知功能障礙相關(guān)，因此，NEP有可能成為AD治療的潛在藥物靶點(diǎn)〔1〕。人參皂苷(Ginsenoside)是人參中的重要活性成分，可明顯改善AD的癥狀〔2〕，但關(guān)于人參皂苷療效與NEP活性關(guān)系的研究尚少。本研究構(gòu)建了模擬AD患者體內(nèi)Aβ水平的sweAPP-SK細(xì)胞株作為模型細(xì)胞，將NEP作為治療靶點(diǎn)，篩選人參皂苷治療AD的有效成分。

1 材料和方法

1.1 材料 人參皂苷購于上海融禾醫(yī)藥有限公司；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、兔抗人APP及羊抗兔二抗購于Gibco公司；噻唑藍(lán)(MTT)、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光系、NEP酶切底物及酶抑制劑購于Sigma公司；Aβ40、Aβ42試劑盒購于IBL公司；神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH購于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，質(zhì)粒pcDNA3.1sweAPP由Sigma公司提供技術(shù)支持。

1.2 構(gòu)建sweAPP-SK細(xì)胞株 SK-N-SH接種24孔板，長至90%以上融合，棄培養(yǎng)基OptiMEM沖洗，然后用OptiMEM分別稀釋pcDNA3.1sweAPP及脂質(zhì)體后混合，室溫孵育，加入細(xì)胞，8 h后加完全培養(yǎng)基，隔天換液，3 w挑選單克隆細(xì)胞株，即為sweAPP-SK細(xì)胞株，繼續(xù)培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和400 μg/L G418)中，長至80%以上融合傳代(1∶3)。

1.3 檢測方法 (1)MTT檢測藥物毒性：接種細(xì)胞至96孔板(104/孔)，長至60%以上后融合，加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)1～3 d，終止培養(yǎng)前4 h每孔加0.5 mg/ml MTT終止培養(yǎng)，棄上清后加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，混勻，檢測吸光度(波長600 nm)。(2)Western印跡檢測sweAPP-SK細(xì)胞株表達(dá)情況：sweAPP-SK接種6孔板，培養(yǎng)至90%以上，融合后棄上清，RIPA裂解，提取總蛋白，測定其濃度，電泳(10%SDS-PAGE、硝酸纖維素膜、160 mA/2 h)，封閉(5%脫脂奶粉)，加一抗(室溫震蕩1 h，4℃過夜)，TBST洗滌后加二抗(室溫震蕩1 h，洗滌)，ECL試劑盒檢測。(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：細(xì)胞接種24孔板，長至60%以上融合，加藥，72 h收上清，分別加入Aβ40、Aβ42試劑盒，4℃孵育過夜，Washing buffer沖洗，加二抗(4℃、1 h)，Washing buffer沖洗，加顯色物(室溫、避光、0.5 h)，加終止液，測定吸光度(波長450 nm)。(4)NEP肽酶實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種24孔板，加藥(72 h)，棄上清，加緩沖液(SAAP-AMC、Tris-HCl、37℃、1 h)，加phosphoramidon，移至eppendorf管，加APN(20 μl、56℃、1 h)，加丙酮(800 μl)，檢測吸光度(激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm)；根據(jù)各自試劑盒說明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算統(tǒng)計(jì)數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 sweAPP-SK細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定 sweAPP-SK細(xì)胞株高表達(dá)APP蛋白，構(gòu)建成功。見圖1。sweAPP-SK細(xì)胞株Aβ40、Aβ42表達(dá)量(298.11±15.27，98.35±8.63)均較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(44.23±12.46，32.14±3.08)明顯增多，分別為轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)量的6.74倍及3.06倍(均P<0.05)。

2.2 人參皂苷組分對SK-N-SH細(xì)胞增殖能力的影響 各皂苷組分最佳作用濃度分別為皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg2 50 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L，Re 50 μmol/L；皂苷組分時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳作用時(shí)間為48～72 h。見表1。

表1 人參皂苷組分對SK-N-SH細(xì)胞增殖能力的 影響

與0 μmol/L比較:1)P<0.05

2.3 人參皂苷組分對NEP活性的影響 人參皂苷Rg1、Rg3 、Rb1組NEP活性分別為對照組細(xì)胞酶活性的(124±3.6)%、(131±4.1)%和(121±3.2)%(均P<0.05)。

2.4 人參皂苷組分Rg1、Rg3、Rb1對sweAPP-SK細(xì)胞株的影響 sweAPP-SK細(xì)胞株經(jīng)Rg1、Rg3、Rb1作用后，培養(yǎng)基Aβ40、Aβ42濃度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 人參皂苷組分Rg1、Rg3、Rb1對sweAPP-SK 細(xì)胞株的影響

與sweAPP-SK比較：1)P<0.05

3 討 論

Bormann等〔3〕研究結(jié)果顯示，遺傳、老化等相關(guān)因素可引起腦組織內(nèi)Aβ 積累，并直接導(dǎo)致Aβ 代謝平衡的相應(yīng)改變，最終導(dǎo)致AD病理過程的啟動(dòng)。因此，尋找和篩選能有效降低Aβ 水平的藥物或藥物成分對于AD患者的治療有重大意義。

Iwata等〔4〕研究結(jié)果顯示，NEP 基因缺陷的小鼠腦組織內(nèi)Aβ 水平明顯上升，而且Aβ 水平升高的程度與NEP 的缺陷程度呈正相關(guān)；另有多項(xiàng)研究表明，在轉(zhuǎn)基因AD模型鼠的腦組織中NEP呈過度表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)可見Aβ水平明顯降低，而且呈劑量依賴性〔5，6〕。研究表明，AD患者腦內(nèi)容易出現(xiàn)Aβ 沉積，形成老年斑，外在表現(xiàn)為NEP mRNA及表達(dá)產(chǎn)物含量明顯降低，同時(shí)可見神經(jīng)變性斑塊部位NEP活性明顯降低〔7〕，提示NEP 在降低腦內(nèi)Aβ水平的過程中可能發(fā)揮至關(guān)重要的作用，NEP 表達(dá)及其活性的增加可以作為AD相關(guān)藥物研究及臨床治療的新靶點(diǎn)。因此，本研究選擇NEP 為靶點(diǎn)進(jìn)行多項(xiàng)人參皂苷活性成分篩選，結(jié)果顯示，Rg1、Rg3、Rb1能夠顯著提高NEP活性。

為了模擬AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元的真實(shí)改變，從而準(zhǔn)確有效地檢測人參皂苷組分對Aβ 水平的影響，本研究利用脂質(zhì)體法構(gòu)建高表達(dá)sweAPP的SK-N-SH 細(xì)胞作為AD的模型細(xì)胞，并命名為swe-APP-SK 細(xì)胞。結(jié)果顯示sweAPP-SK 細(xì)胞除了能夠高表達(dá)APP以外，同時(shí)也可以使細(xì)胞外Aβ40、Aβ42水平明顯升高。然后再以高表達(dá)APP 的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為模型細(xì)胞進(jìn)行ELISA 試驗(yàn)，結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L可以明顯降低細(xì)胞外Aβ40及Aβ42水平。目前研究結(jié)果認(rèn)為，人參皂苷是人參的重要活性成分，在體內(nèi)能起到神經(jīng)保護(hù)作用，其中人參皂苷Rb1 是作用于神經(jīng)系統(tǒng)的主要成分〔8〕，但其對NEP活性影響的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1 能夠明顯增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞NEP活性，明顯降低細(xì)胞外Aβ40 及Aβ42水平。人參皂苷Rg3作為人參的重要成分之一，對于其在神經(jīng)系統(tǒng)方面的作用，尤其在AD中的作用機(jī)制及療效方面的研究甚少，本研究將人參皂苷Rg3 作用于AD模型細(xì)胞swe-APP-SK，研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3 也能明顯提高神經(jīng)細(xì)胞NEP的活性，同時(shí)可以有效降低細(xì)胞外Aβ40及Aβ42水平。人參皂苷Rb1同樣可以作為人參的有效成分，提高神經(jīng)細(xì)胞NEP的活性、降低細(xì)胞外Aβ40及Aβ42水平。

綜上所述，本研究在成功構(gòu)建AD模型細(xì)胞swe-APP-SK、篩選出最佳作用濃度和作用時(shí)間基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、Rg3以及Rb1均可明顯提高神經(jīng)細(xì)胞NEP活性，同時(shí)可以明顯降低細(xì)胞外Aβ40及Aβ42水平，為人參皂苷應(yīng)用于AD的臨床治療提供重要依據(jù)。

1 楊玲玲，張 靜，崔云燕，等.以神經(jīng)內(nèi)肽酶為靶點(diǎn)篩選治療阿爾茨海默癥天然藥物的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009；47(1)：10-4.

2 李 源，劉 穎，袁海峰，等.人參皂苷Rg1對阿爾茨海默病模型大鼠腦片磷酸化Tau蛋白及膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(6)：1640-1.

3 Bormann H，Melzig MF.Inhibition of metallopeptidases by flavonoids and related compounds〔J〕.Pharmazie，2000；55(2)：129-32.

4 Iwata N，Tsubuki S，Takaki Y，etal.Metabolic regulation of brain Abeta by neprilysin〔J〕.Science，2001；292(5521)：1550-2.

5 Marr RA，Guan H，Rockenstein E，etal.Neprily sin regulates amyloid Beta peptide levels〔J〕.J Mol Neurosci，2004；22(1-2)：5-11.

6 Mohajeri MH，Kuehnle K，Li H，etal.Anti-amyloid activity of neprilysin in plaque-bearing mouse models of Alzheimer′s disease〔J〕.FEBS Lett，2004；562(1-3)：16-21.

7 Iwata N，Takaki Y，F(xiàn)ukami S，etal.Region-specific reduction of a beta-degrading endopeptidase，neprilysin，in mouse hippocampus upon aging〔J〕.J Neurosci Res，2002；70(3)：493-500.

8 沈思鈺，干振華，傅曉東，等.人參皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究現(xiàn)狀及分析〔J〕.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004；23(1)：62-4.

〔2016-04-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

樂山市科技局重點(diǎn)研究項(xiàng)目(No.15ZDYJ0150)

陳 曦(1983-)，女，主治中醫(yī)師，主要從事老年疾病康復(fù)研究。

彭 靜(1983-)，女，講師，主治中醫(yī)師，碩士，主要從事針灸康復(fù)治療老年性疾病研究。

R331

A

1005-9202(2017)05-1089-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.022

1 樂山市市中區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)科

2 樂山市中醫(yī)醫(yī)院針灸康復(fù)科