李 濤 李秀山 計彥新 葛 虹 王紅斌

(河北工程大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外二科，河北 邯鄲 056002)

雌激素預(yù)防切除卵巢大鼠顱內(nèi)動脈瘤破裂的效果及機制

李 濤 李秀山 計彥新1葛 虹2王紅斌3

(河北工程大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外二科，河北 邯鄲 056002)

目的 探討雌激素預(yù)防切除卵巢大鼠顱內(nèi)動脈瘤破裂的效果及作用機制。方法 140只雌性Wistar大鼠隨機分為賦形劑組、雌激素治療組、雌激素+ER受體拮抗劑治療組、ER-α受體激動劑治療組、ER-β受體激動劑治療組、一氧化氮(NO)合成抑制劑N-亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)治療組、ER-β受體激動劑治療+L-NAME治療組，每組20只，均進行切除雙側(cè)卵巢+制作動脈瘤模型。醋酸去氧皮質(zhì)酮(DOCA)-鹽型誘導顱內(nèi)動脈瘤小鼠形成的模型，各組分別于DOCA注射后第6天給予賦形劑二甲基亞砜(DMSO)、17-β-雌二醇、17-β-雌二醇聯(lián)合ER拮抗劑、ER-α亞型激動劑(PPT)、ER-β亞型激動劑(DPN)、L-NAME、DPN聯(lián)合L-NAME，大鼠出現(xiàn)動脈瘤破裂癥狀時處死，或給藥持續(xù)至DOCA注射后第21天時處死。統(tǒng)計分析各組動脈瘤形成情況以及破裂的動脈瘤發(fā)生率和動脈瘤破裂率。結(jié)果 雌激素治療組破裂的動脈瘤發(fā)生率及動脈瘤破裂率顯著低于賦形劑組和雌激素+ER拮抗劑組，ER-β受體激動劑組顯著低于賦形劑組(P<0.05)，ER-α受體激動劑組與賦形劑組比較無顯著差異(P>0.05)。與賦形劑組比較，L-NAME組破裂的動脈瘤發(fā)生率及動脈瘤破裂率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，ER-β受體激動劑+L-NAME組顯著高于ER-β受體激動劑組(P<0.05)。結(jié)論 雌激素能夠預(yù)防切除卵巢大鼠顱內(nèi)動脈瘤破裂，可能與雌激素刺激ER-β受體激活有關(guān)，且這種作用依賴于NO的產(chǎn)生。

雌激素；絕經(jīng)；顱內(nèi)動脈瘤破裂

研究表明雌激素可能具有潛在的保護作用，預(yù)防絕經(jīng)后婦女動脈瘤破裂〔1，2〕。已經(jīng)有動物實驗表明，雌激素能夠預(yù)防動脈瘤的形成〔3〕。然而，目前尚沒有實驗研究發(fā)現(xiàn)雌激素對動脈瘤破裂是否具有預(yù)防作用。本研究評估了雌激素和非選擇性雌激素受體(ER)抑制劑對切除卵巢的雌性大鼠動脈瘤破裂的影響，其中切除卵巢的雌性老鼠用于模擬絕經(jīng)后婦女的狀況。本研究參考相關(guān)文獻〔4～6〕，使用一個概括了人類顱內(nèi)動脈瘤主要特點(包括自發(fā)破裂)的顱內(nèi)動脈瘤大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 140只SPF級雌性Wistar大鼠，均購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK粵2006-0015，8～10周齡，體質(zhì)量(220±20)g。隨機分為賦形劑組、雌激素治療組、雌激素+ER受體拮抗劑治療組、ER-α受體激動劑治療組、ER-β受體激動劑治療組、一氧化氮(NO)合成抑制劑N-亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)治療組、ER-β受體激動劑治療+L-NAME治療組，每組20只，均進行切除雙側(cè)卵巢+制作動脈瘤模型。具體方法：稱重，3.6%的水合氯醛麻醉，麻醉生效后剪去腹部和腿部鼠毛，并固定于手術(shù)臺，取下腹正中切口充分暴露膀胱，沿膀胱旁邊脂肪中的子宮找到一側(cè)卵巢，結(jié)扎切除雙側(cè)卵巢，制作去卵巢大鼠模型。止血后關(guān)閉腹腔并常規(guī)消毒。下一步進行醋酸去氧皮質(zhì)酮(DOCA)-鹽型大鼠模型建立，取脊柱左側(cè)、第12肋下緣切口充分暴露左腎，結(jié)扎腎靜、動脈，切除左側(cè)腎臟，逐層縫合并常規(guī)消毒。大鼠自然蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)1 w，但飲用1%的生理鹽水。術(shù)后1 w給予5 mg DOCA溶液皮下注射，2次/w，按照周一、周五間隔給藥，連續(xù)給藥3 w共21 d，自由攝食，飲用1%的生理鹽水。

1.2 給藥方法 參考相關(guān)文獻〔5〕，各組于DOCA注射后第6天給藥，賦形劑組、雌激素治療組、雌激素+ER受體拮抗劑治療組、ER-α受體激動劑治療組、ER-β受體激動劑治療組、L-NAME治療組、ER-β受體激動劑治療+L-NAME治療組分別給予賦形劑二甲基亞砜(DMSO)0.17 mg/kg、17-β-雌二醇0.17 mg/kg、17-β-雌二醇(0.17 mg/kg)聯(lián)合ER拮抗劑(3 mg/kg)、ER-α亞型激動劑(PPT)0.17 mg/kg、ER-β亞型激動劑(DPN)0.17 mg/kg、L-NAME 1 mg/kg、DPN(0.17 mg/kg)聯(lián)合L-NAME(1 mg/kg)，1次/d。相關(guān)試劑均購自上海亨代勞生物有限公司，給藥劑量均參照過往文獻〔7〕。給藥持續(xù)至DOCA注射后第21天或處死時。

1.3 動脈瘤破裂和動脈瘤判斷標準 出現(xiàn)以下任何癥狀之一即可判斷為動脈瘤破裂〔5〕：①體重減輕(體重減少超過10%且持續(xù)24 h)，飲食和飲水明顯減少；②軀干彎曲，前肢抬起；③以正常的姿勢沿一邊繞行；④休息時傾倒在一邊；⑤沒有自發(fā)性的活動。各組出現(xiàn)上述癥狀后處死，記錄處死時的時間，其余未出現(xiàn)癥狀的于DOCA注射后第21天處死。取同載瘤動脈大腦樣本，磷酸鹽緩沖鹽水灌注，然后灌注包含藍色染料的明膠顯現(xiàn)腦動脈，動脈瘤被定義為局部向外膨脹的血管壁直徑大于主動脈直徑。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗；繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗進行生存分析。

2 結(jié) 果

2.1 造模一般情況 造模過程中賦形劑組、雌激素治療組、雌激素+ER受體拮抗劑治療組、ER-α受體激動劑治療組、ER-β受體激動劑治療組、L-NAME治療組、ER-β受體激動劑治療+L-NAME治療組分別有1只、3只、3只、8只、5只、5只、4只大鼠死亡。

2.2 雌激素對去卵巢大鼠動脈瘤破裂的影響 賦形劑組、雌激素治療組以及雌激素+ER拮抗劑組顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生率無統(tǒng)計學意義(73.68% vs 76.47% vs 82.35%，P>0.05)，說明雌激素以及雌激素+拮抗劑治療并未影響顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生率；雌激素治療組破裂的動脈瘤發(fā)生率(17.65%)以及動脈瘤破裂率(23.08%)顯著低于賦形劑組(63.16%、85.71%)和雌激素+ER拮抗劑組(58.82%、71.43%)(P<0.05)；通過繪制Kaplan-Meier生存曲線并采用log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，在排除未發(fā)生動脈瘤的大鼠之后，雌激素治療組動脈瘤破裂率顯著降低(P<0.05)。見圖1。

與賦形劑組比較：1)P<0.05；與雌激素+ER拮抗劑組比較：2)P<0.05；同下圖 圖1 雌激素預(yù)防去卵巢大鼠動脈瘤破裂

2.3 雌激素預(yù)防去卵巢大鼠動脈瘤破裂作用的受體亞型 賦形劑組、ER-α以及ER-β受體激動劑組顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生率無統(tǒng)計學意義(73.68% vs 66.67% vs73.33%，P>0.05)；ER-β受體激動劑組破裂的動脈瘤發(fā)生率(13.33%)以及動脈瘤破裂率(18.18%)顯著低于賦形劑組(63.16%、85.71%，P<0.05)；通過繪制Kaplan-Meier生存曲線并采用log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，在排除未發(fā)生動脈瘤的大鼠之后，ER-β受體激動劑組動脈瘤破裂率顯著降低(P<0.05)。而ER-α受體激動劑組(50.00%、75.00%)與賦形劑組(63.16%、85.71%)破裂的動脈瘤發(fā)生率以及動脈瘤破裂率均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 雌激素刺激ER-β預(yù)防去卵巢大鼠動脈瘤破裂

2.4 雌激素刺激ER-β依賴于NO的產(chǎn)生 與賦形劑組比較，L-NAME組破裂的動脈瘤發(fā)生率(53.33%)及動脈瘤破裂率(61.54%)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；ER-β受體激動劑+L-NAME組(68.75%，78.57%)顯著高于ER-β受體激動劑組(13.33%、18.18%)(P<0.05)。見圖3。

與賦形劑組比較：1)P<0.05；與ER-β受體激動劑+L-NAME組比較：2)P<0.05 圖3 雌激素刺激ER-β依賴于NO的產(chǎn)生

3 討 論

本研究結(jié)果表明，雌激素能夠預(yù)防切除卵巢的雌性大鼠動脈瘤破裂，與流行病學研究結(jié)果相符合〔1〕。ER-β在人腦動脈和顱內(nèi)動脈瘤中呈陽性表達，而雌激素的這種預(yù)防作用可能與刺激ER-β激活有關(guān)。此外，雌激素刺激ER-β保護顱內(nèi)動脈瘤預(yù)防破裂還依賴于NO的產(chǎn)生。本文結(jié)果認為雌激素通過刺激ER-β預(yù)防顱內(nèi)動脈瘤破裂。

在切除卵巢的雌性大鼠(即絕經(jīng)后大鼠)中，發(fā)現(xiàn)雌激素刺激ER-β激活保護顱內(nèi)動脈瘤破裂的作用依賴于NO的產(chǎn)生。與本研究結(jié)果類似，諸多研究均表明雌激素的心血管保護效應(yīng)是由ER-β以NO依賴方式介導的〔8，9〕。ER-β激活不僅可以刺激誘導內(nèi)皮NO合成酶的表達，同時也能增加NO的生成〔10〕。顱內(nèi)動脈瘤的病理生理與急、慢性炎癥密不可分，而內(nèi)皮NO合成酶和NO參與了急、慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展〔11〕。NO對各種蛋白質(zhì)巰基亞硝基化可以防止半胱氨酸殘基的氧化修飾，可能減少過度的組織重構(gòu)，從而降低動脈瘤破裂風險〔9〕。本研究仍然存在一定的局限性：NO合成酶有多種類型，目前尚不清楚哪種類型的NO合成酶能夠應(yīng)答ER-β發(fā)揮保護作用，也不清楚是哪種蛋白質(zhì)巰基亞硝基化。在以后的實驗中將利用特定亞型硝酸氧化氮合酶抑制劑以及特定亞型的NO合成酶基因敲除小鼠進一步深入研究。

本研究中另外一個局限性在于使用了8～10 w相對年輕的大鼠。雌性大鼠約在7 w左右進入生殖期，在12～14個月左右進入更年期。多數(shù)研究評估雌激素對絕經(jīng)期的作用均選擇8～10周齡卵巢切除的雌性大鼠〔12〕。然而，相對年輕的絕經(jīng)前卵巢切除大鼠可能并不能完全模擬出正常年長大鼠的更年期生理〔13〕。卵巢切除可導致卵巢激素的突然損失并繞過以雌激素的逐漸損失和波動為特征的圍絕經(jīng)期〔13〕。由于年齡相關(guān)的各組織和應(yīng)答的變化，在生育年齡早期階段和晚期階段，卵巢切除和雌激素治療的效果可能不同〔13〕。此外，在絕經(jīng)早期和晚期階段，ER的表達水平、靈敏度以及應(yīng)答也存在差異〔14〕。更年期會引起雌激素和孕激素缺失，孕激素可以通過調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激改善缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷動物預(yù)后，在神經(jīng)保護作用方面，孕激素和雌激素可能存在一定的相互作用；此外，睪酮能夠激活促炎癥因子或調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激增加炎癥反應(yīng)〔15〕。大腦血管炎癥可能受雌激素、睪酮、孕激素之間平衡的影響。

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〔2016-07-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

邯鄲市科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(No.1523108076-2)

王紅斌(1970-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病、顱底外科、腦腫瘤等研究。

李 濤(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事出血性腦血管病的介入治療研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)05-1081-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.019

1 邢臺市中醫(yī)院康復(fù)科 2 邯鄲市第一醫(yī)院護理部

3 河北工程大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科