尹興忠 趙冬梅 田國(guó)忠 王長(zhǎng)山 趙春紅 李 麗 歐葉濤

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞c-fos表達(dá)的影響

尹興忠 趙冬梅1田國(guó)忠 王長(zhǎng)山 趙春紅 李 麗 歐葉濤

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 研究慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞c-fos表達(dá)的變化及生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)對(duì)其表達(dá)的影響。方法 Wistar老年大鼠90只隨機(jī)分為治療組、模型組和對(duì)照組，每組30只。通過電鏡、免疫組化觀察心衰大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化、RT-PCR法檢查各組大鼠心肌細(xì)胞中c-fos mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)治療組大鼠心肌較模型組明顯改善，但略差于對(duì)照組。免疫組織化學(xué)方法、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌中c-fos mRNA光密度值明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；治療組大鼠心肌c-fos mRNA光密度值較模型組明顯降低(P<0.01)，但略高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 GHRP可降低慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞c-fos含量而保護(hù)和改善心衰大鼠心功能。

生長(zhǎng)激素釋放肽；慢性心衰；c-fos

c-fos基因在心肌細(xì)胞缺血、缺氧、血流動(dòng)力超負(fù)荷等快速誘導(dǎo)表達(dá)，導(dǎo)致心肌的蛋白比例改變從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞重塑的各種細(xì)胞外信號(hào)通過多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起細(xì)胞應(yīng)答，c-fos是一個(gè)通用的轉(zhuǎn)錄因子。生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)和興奮-收縮耦聯(lián)的過程，促使心肌纖維的活動(dòng)接近于正常，同時(shí)還可以促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)并具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用〔1，2〕。本研究探討GHRP對(duì)心衰后大鼠心肌細(xì)胞中c-fos表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備 ①試劑：免疫組化試劑(武漢博士德生物工程有限公司)；RT-pCR試劑(大連寶生物有限公司)。②藥品：水合氯醛、無水甲醇、乙醇、無水乙醇、乙醚、Tris堿等為本生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：老年Wistar大鼠，體重(200±30)g，90只，佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：黑動(dòng)字第99102001)。④設(shè)備：小動(dòng)物呼吸機(jī)、梯度PCR儀(Whatman公司生產(chǎn))、心電圖機(jī)：ECG-6511。

1.2 方法 (1)模型制備〔3，4〕：隨機(jī)分為治療組、模型組和對(duì)照組，采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支法造成心肌梗死后形成慢性心衰模型。實(shí)驗(yàn)用成年、健康Wistar大鼠90只。(2)取材：連續(xù)給藥4 w后，檢查大鼠各組的心功能，取材前禁食12 h，取材后立即液氮冷凍，-80℃保存；取部分左心室心肌，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。(3) 心肌 RT-PCR 檢測(cè)：①總RNA提?。喝⌒募〗M織50 mg液氮中研磨成粉末加入含1 ml Trizol的EP管中，稱重充分混勻室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min，吸取上清液至新EP管中加入200 μl氯仿用力振蕩15 s混勻，室溫靜置5 min ，12 000 r/min 4℃離心15 min ，吸取上清液500 μl至新EP管中，加入500 μl異丙醇充分混勻室溫靜置10 min 12 000 r/min 4℃離心，5 min棄上清向沉淀中緩慢加入1 ml 75%乙醇清洗，12 000 r/min 4℃離心5 min棄上清保留沉淀室溫干燥5～10 min，溶解于30 μl DEPC處理水中10 μl用于RNA純度等檢測(cè)，20 μl置于液氮中凍存。②反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA：在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫中檢索，得到大鼠c-fos和β-actin的完整cDNA序列，各基因上下游引物應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，然后在BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性對(duì)比，最終得到特異的引物序列。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡下觀察變化 對(duì)照組可見，肌原纖維排列整齊、緊密，肌節(jié)，Z線及M線清晰，線粒體正常，膜完整。模型組心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)可見肌原纖維溶解，嵴變疏短、Z線及M線模糊不清線粒體腫脹，破裂，線粒體膜不完整，有空泡樣改變，治療組與模型組比較，心肌結(jié)構(gòu)顯著改觀，肌纖維各帶較為鮮明，線粒體排列較規(guī)則，呈圓形、橢圓形或長(zhǎng)桿狀，嵴膜方向較規(guī)則。見圖1。

2.2 免疫組化法觀察各組大鼠心肌細(xì)胞c-fos表達(dá)的變化 模型組大鼠心肌細(xì)胞中 c-fos明顯高于對(duì)照組c-fos(P<0.01)；治療組大鼠心肌細(xì)胞中c-fos較模型組明顯降低(P<0.01)，見圖2，表1。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)c-fos mRNA在心肌組織的表達(dá) 模型組大鼠心肌細(xì)胞中c-fos mRNA明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；治療組大鼠心肌細(xì)胞中c-fos mRNA較模型組明顯降低(P<0.01)，但高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖3，表1。

圖1 各組心肌組織超微結(jié)構(gòu)比較(×80 000)

圖2 各組心肌組織c-fos表達(dá)(DAB,×200)

Marker;1.模型組;2.治療組;3.對(duì)照組 圖3 各組心肌組織c-fos mRNA表達(dá)表1 GHRP對(duì)心衰大鼠心肌c-fos、c-fos mRNA表達(dá)的 影響

組別c-fosc-fosmRNA對(duì)照組1.90±0.089466±49模型組4.18±0.721)521±951)治療組2.87±0.0472)3)485±382)3)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.01

3 討 論

多種原因可以導(dǎo)致心臟的功能失常，從而使心臟輸出量相對(duì)或絕對(duì)下降，以至不能適應(yīng)機(jī)體代謝需要的生理過程，而使機(jī)體表現(xiàn)出一系列臨床癥狀的總稱，這樣的病理過程可不斷地發(fā)展，這個(gè)過程是心肌重塑與內(nèi)分系統(tǒng)興奮性增強(qiáng)形成相互促進(jìn)的惡性循環(huán)，所以難以臨床治療改善慢性心衰，這也是多數(shù)心臟疾病死亡的主要原因〔5〕。

c-fos是構(gòu)成核轉(zhuǎn)錄激活因子的主要部分屬于早期即刻基因中的一類分別位于14q21-31〔6〕分子量均為62 000 D左右，多因素(生長(zhǎng)因子、佛波脂、神經(jīng)遞質(zhì)、氧張力變化炎癥因子、白細(xì)胞介素等)刺激細(xì)胞多表達(dá)c-fos，表達(dá)增加的c-fos通過對(duì)下游基因表達(dá)的調(diào)控引起體內(nèi)細(xì)胞的一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能代謝變化。c-fos基因是原癌基因，在維持細(xì)胞的生理功能、分化和生長(zhǎng)方面起著十分重要的作用，是生物體內(nèi)一種非常重要的基因。缺血缺氧時(shí)心肌細(xì)胞中c-fos基因大量表達(dá)，表達(dá)增加的c-fos基因調(diào)控下游基因。在正常條件下c-fos 參與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化的過程〔7〕，在生長(zhǎng)、分化和增殖現(xiàn)象很少的細(xì)胞中c-fos 表達(dá)量很少甚至不表達(dá)，所以在成熟正常細(xì)胞中其很少有表達(dá)〔8，9〕，未成熟細(xì)胞由于未分化成熟所以在生長(zhǎng)分化和增殖的過程中細(xì)胞中會(huì)有c-fos持續(xù)表達(dá)，GHRP對(duì)心衰大鼠心肌中c-fos表達(dá)及含量變化的實(shí)驗(yàn)研究甚少。本文顯示GHRP通過抑制心肌組織中C-fos的表達(dá)，從而改善心肌功能，減緩心臟衰竭發(fā)展的進(jìn)程。

1 李春陵，顧廣富，羅建華，等.益氣溫陽活血方含藥血清對(duì)大鼠肥大心肌細(xì)胞原癌基因 c-fos、c-myc 表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(17)：4897-9.

2 丁 帆，程秀麗，郝 維，等.hexarelin 的細(xì)胞保護(hù)作用研究〔J〕.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012;41(10)：21-3.

3 魏 罡，田國(guó)忠，李梅秀，等.心力衰竭大鼠外周血生長(zhǎng)分化因子-15及其心肌組織中mRNA表達(dá)水平〔J〕.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012；41(11)：57-6.

4 趙 勇，鐘震亞，田國(guó)忠，等.生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)心衰大鼠心肌組織中IL-6的影響〔J〕.解剖學(xué)研究，2007；29(3)：186-94.

5 張?zhí)飳?，周美啟，吳生兵，?不同干預(yù)方法對(duì)心肌缺血c-fos 基因表達(dá)的影響〔J〕.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013；8(6)：630-2.

6 Chen HB，Wang L，Jiang JF.Re-analysis of expression profiles for revea-ling new potential candidate genes of heart failure〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013；17(7)：903-11.

7 李瑩潔，柏樹令.慢性壓力負(fù)荷所致心肌肥厚及心衰大鼠左心室肌ERK的動(dòng)態(tài)變化〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2004;24(6)：544-6.

8 馮 佳，田國(guó)忠.生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)心衰大鼠植物神經(jīng)重構(gòu)的影響〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2009；25(4)：453-6.

9 徐繼杰，劉 斌，方 卓，等.從慢性心力衰竭學(xué)說的發(fā)展認(rèn)識(shí)和掌握其現(xiàn)代藥物治療觀點(diǎn)〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2006;26(2)：285-7.

〔2015-12-12修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

黑龍江省教育廳項(xiàng)目(No.12541801)

田國(guó)忠(1966-)，男，教授，博士，主要從事心衰的發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)治療研究。

尹興忠(1979-)，男，碩士，講師，主要從事心衰機(jī)制及其生物學(xué)治療研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)05-1069-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.013

1 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒二科