周媛媛 李超彥 王福青 楚憲襄

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 漯河 462002)

A型肉毒毒素對P物質(zhì)引發(fā)的離體食管下括約肌收縮的抑制作用

周媛媛 李超彥 王福青 楚憲襄1

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 漯河 462002)

目的 觀察A型肉毒毒素(BTX-A)對電場刺激(EFS)、內(nèi)源性及外源性P物質(zhì)(SP)引發(fā)的SD大鼠離體食管下括約肌(LES)收縮的影響。方法 SD大鼠叩擊頭部致昏后剪取食管下段與賁門交界處組織制備肌條。使用EFS誘發(fā)肌條內(nèi)源性遞質(zhì)釋放，阿托品阻斷膽堿受體作用后，觀察NK1受體拮抗劑(APTL-SP)、BTX-A對LES收縮的影響；觀察不同濃度APTL-SP、BTX-A，對外源性SP引發(fā)的LES收縮變化影響。采用Biolap BL-420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)同步記錄肌條的收縮變化曲線。結(jié)果 EFS可增強(qiáng)LES的收縮張力及振幅(P<0.01)，BTX-A、阿托品、APTL-SP均可單獨抑制其效應(yīng)(P<0.05或P<0.01)，而阿托品作用后BTX-A可進(jìn)一步降低LES的收縮張力及振幅(P<0.05)；EFS的增強(qiáng)LES收縮效應(yīng)，在被阿托品抑制后，可被后加入的APTL-SP進(jìn)一步抑制(P<0.05)；阿托品與APTL-SP對EFS引發(fā)的LES收縮的協(xié)同抑制效應(yīng)和BTX-A的抑制效應(yīng)對比，二者無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。外源性加入的SP可顯著增強(qiáng)LES收縮張力(P<0.01)及振幅(P<0.05)。結(jié)論 BTX-A可抑制EFS誘發(fā)的內(nèi)源性SP引發(fā)的LES縮增強(qiáng)，其對外源性SP引發(fā)的LES收縮也具有抑制效應(yīng)。

A型肉毒毒素；P物質(zhì)；食管下括約?。浑妶龃碳?/p>

A型肉毒毒素(BTX-A)是革蘭陽性厭氧肉毒桿菌在繁殖過程中產(chǎn)生的外毒素， 可裂解神經(jīng)-骨骼肌突觸前膜內(nèi)的突觸囊泡膜上的SNAP-25蛋白，導(dǎo)致含乙酰膽堿(ACh)的囊泡出胞障礙，阻礙了ACh的釋放而導(dǎo)致骨骼肌松弛、麻痹〔1～3〕。目前針對BTX-A對平滑肌收縮作用機(jī)制研究較少，近年研究發(fā)現(xiàn)，BTX-A對SD大鼠胃體、胃底及食管下括約肌(LES)等離體平滑肌的自發(fā)性收縮及P物質(zhì)(SP)引發(fā)的收縮存在抑制作用〔4,5〕。本研究擬觀察BTX-A對電場刺激(EFS)誘發(fā)的內(nèi)源性和外源性加入的SP所致的LES收縮的影響，結(jié)合NK1受體拮抗劑(APTL-SP)、阿托品藥理效應(yīng)，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠55只，體重280～320 g，雌雄不拘，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供(合格證號醫(yī)動字第20120133號)。

1.2 藥品與試劑 阿托品、SP、APTL-SP均購自Sigma公司；凍干BTX-A(100 U/安瓿，-20℃閉光保存)蘭州生物制品研究所。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 HW-400S恒溫平滑肌槽(四川成都泰盟科技有限公司)，聯(lián)想微型兼容計算機(jī)內(nèi)置Biolap 420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(四川成都泰盟科技有限公司)，JH-2型張力傳感器(北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所)，銀片電極(自制)。

1.4 標(biāo)本制備 實驗前大鼠禁食18～24 h，飲水不限；實驗時叩擊其頭部致昏，迅速剖腹剪取食管下段與胃賁門交界處組織；沿長軸切開平滑肌后，采用自制切割器剪取制備長8 mm、寬2 mm的LES肌條，每只大鼠組織可制備2～3條。將肌條溫育于預(yù)充滿37℃Kreb液的恒溫平滑肌槽中孵育，肌條一端固定在肌槽底部的玻璃彎鉤上，另一端固定在張力傳感器上，肌條長軸與電極長軸平行，肌槽內(nèi)持續(xù)供給含95%O2和5%CO2混合氣體。肌條溫育30 min后，以出現(xiàn)自發(fā)性收縮為標(biāo)準(zhǔn)選作為實驗標(biāo)本。

1.5 分組與給藥 LES肌條隨機(jī)分為10組，每組10條：①EFS組，在自發(fā)性收縮的條件下記錄30 min，附加EFS；②EFS+阿托品組，附加EFS，后加入阿托品(1 μmol/L)；③EFS+BTX-A組，附加EFS，后加入BTX-A(10 U/ml)；④EFS+APTL-SP組，附加EFS，加入APTL-SP(1 μmol/L)；⑤EFS+阿托品+APTL-SP組；⑥EFS+阿托品+BTX-A組，附加EFS，后加入阿托品(1 μmol/L)，再加入APTL-SP(1 μmol/L)或BTX-A(10 U/ml)；⑦EFS+BTX-A+APTL-SP組，附加EFS，后加入BTX-A(10 U/ml)，再加入APTL-SP(1 μmol/L)；⑧SP組，在自發(fā)性收縮的條件下記錄30 min，后加入SP(1 μmol/L)；⑨SP+APTL-SP組，加入SP (1 μmol/L)，后加入APTL-SP(1 μmol/L)；⑩SP+BTX-A組，加入SP (1 μmol/L)，后加入BTX-A(10 U/ml)。各實驗組中附加EFS的參數(shù)(頻率4 Hz、電壓100 V、0.5波寬、60 s持續(xù)刺激〔2〕)設(shè)置均相同，且在附加EFS之前均預(yù)先加入NO酯酶抑制劑(L-NAME)抑制NO介導(dǎo)的肌肉松弛作用。每次附加EFS或加入各種藥物后均需持續(xù)記錄LES收縮波形30 min，LES肌條預(yù)孵育TSN(29.6 μmol/L)的時間均為30 min。在①和⑧分別以EFS或加藥前LES平滑肌的自發(fā)性收縮波形作為對照。各組平滑肌條收縮變化經(jīng)張力傳感器轉(zhuǎn)換，由Biolap 420-E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)同步記錄收縮張力及振幅等實驗數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 BTX-A抑制內(nèi)源性SP引發(fā)的LES的收縮 與對照組比較，附加EFS刺激后，在EFS組可見LES收縮張力及振幅均顯著增大(P<0.01)；附加EFS后引發(fā)的平滑肌收縮增強(qiáng)，在加入BTX-A或阿托品或APTL-SP均可被抑制(P<0.05或P<0.01)，持續(xù)記錄30 min未見收縮張力及振幅回升。與EFS+阿托品組比較，EFS +阿托品+ APTL-SP組在加入APTL-SP后，LES的收縮張力及振幅均下降(P<0.05)；與EFS+阿托品組比較，EFS+阿托品+BTX-A組在加入BTX-A后，LES平滑肌的收縮張力及振幅均進(jìn)一步下降(P<0.05)，且其抑制效應(yīng)與EFS+阿托品+APTL-SP及EFS+BTX-A比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 BTX-A抑制外源性SP引發(fā)的LES平滑肌收縮 在LES自發(fā)性收縮狀態(tài)下，加入外源性SP后，與對照組比較可迅速引起LES收縮張力及振幅增大(P<0.01或P<0.05)，且持續(xù)記錄30 min內(nèi)LES收縮波形未見變化；在SP + APTL-SP組，外源性SP引發(fā)LES收縮增強(qiáng)后，加入APTL-SP后可見LES收縮幅度明顯下降(P<0.01或P<0.05)。與SP組比較，SP + BTX-A組LES的收縮同樣可被外源性SP增強(qiáng)，但其效應(yīng)可被APTL-SP或BTX-A抑制(P<0.01或P<0.05)，且持續(xù)記錄30 min內(nèi)LES收縮波形未見回升。見表2。

表1 BTX-A、APTL-SP對內(nèi)源性SP引發(fā)的LES 收縮的影響

與對照組比較：1)P<0.01；與EFS組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與EFS + 阿托品組比較：4)P<0.05

表2 BTX-A、APTL-SP對外源性SP引發(fā)的LES 平滑肌收縮的作用

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與SP組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

LES的興奮收縮主要由腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)興奮性神經(jīng)元釋放的ACh、SP等神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)〔6〕；如腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)LES緊張度的抑制性神經(jīng)元功能受損，則導(dǎo)致其釋放的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)減少，而興奮性神經(jīng)元釋放的ACh、SP等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)或相對增多，導(dǎo)致LES 緊張度增加，進(jìn)而出現(xiàn)食管內(nèi)壓力增高、痙攣及松弛不良等賁門失弛緩癥狀〔7,8〕。近年來，內(nèi)鏡下LES內(nèi)BTX-A注射治療賁門失弛緩癥逐漸得到重視，推測其機(jī)制為抑制平滑肌層內(nèi)膽堿能神經(jīng)末梢ACh的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉松弛〔2〕。我們前期研究表明，BTX-A可抑制神經(jīng)末梢釋放的內(nèi)源性ACh或外源性加入的ACh引發(fā)的LES離體平滑肌收縮〔5,9〕。SP可通過與突觸后膜上的NK1受體特異性結(jié)合，激活Ca2+通道開放，引發(fā)外鈣內(nèi)流，增加胞內(nèi)cAMP水平，導(dǎo)致胃腸道平滑肌收縮；ACh、SP及NO合酶等遞質(zhì)被認(rèn)為共存于同一個神經(jīng)元內(nèi)，在神經(jīng)元興奮的同時通過突觸前膜的出胞機(jī)制同步協(xié)同釋放出來〔10〕。本研究結(jié)果提示BTX-A的抑制效應(yīng)與抑制突觸前膜興奮性神經(jīng)遞質(zhì)ACh、SP等釋放有關(guān)；推測其機(jī)制可能為ACh、SP共存于同一個興奮性神經(jīng)元的軸突末梢突觸囊泡內(nèi)〔10〕，BTX-A通過裂解SNAP-25蛋白而抑制突觸囊泡的移動、融合同時，既阻滯了ACh釋放，又抑制了SP的釋放。外源性SP的對LES收縮增強(qiáng)效應(yīng)，在APTL-SP加入后受到抑制，其機(jī)制與APTL-SP競爭性與NK1受體結(jié)合阻斷SP有關(guān)〔11〕。本文結(jié)果提示BTX-A可能對突觸后膜存在抑制效應(yīng)，推測BTX-A或可直接抑制突觸后膜上的NK1受體功能，或具有破壞NK1受體蛋白結(jié)構(gòu)的能力，但其抑制外源性SP發(fā)揮效應(yīng)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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〔2015-05-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河南省教育廳自然科學(xué)研究資助項目(2011C310012)；漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校自然科學(xué)研究資助項目(2010S11)

周媛媛(1981-)，女，碩士，副教授，主要從事神經(jīng)、胃腸功能康復(fù)研究。

R333.2；R571

A

1005-9202(2017)05-1063-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.010

1 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室