周 飛 齊曉嵐 吳昌學(xué) 官志忠 李 毅

(貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025)

SH-SY5Y細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對α7尼古丁受體蛋白水平的影響

周 飛1齊曉嵐1吳昌學(xué)1官志忠1李 毅1

(貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025)

目的 研究p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路激動(dòng)及抑制對SH-SY5Y細(xì)胞α7神經(jīng)型乙酰膽堿受體 (nAChR) 蛋白水平的影響并探討受體蛋白與p38通路之間的關(guān)系。方法 分別用p38 MAPK激活劑Anisomycin和p38 MAPK阻斷劑SB203580激動(dòng)和阻斷SH-SY5Y細(xì)胞p38 MAPK通路蛋白的活化及其表達(dá)，Western印跡方法檢測α7 nAChR蛋白水平。結(jié)果 細(xì)胞經(jīng)Anisomycin處理后，p38 MAPK蛋白表達(dá)不變，p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白水平升高了71%(P<0.01)，同時(shí)細(xì)胞α7 nAChR蛋白表達(dá)升高了80%(P<0.01).細(xì)胞經(jīng)SB203580處理后，p38 MAPK蛋白表達(dá)不變，p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白水平降低了62%(P<0.01)，提示p38 MAPK信號(hào)通路被抑制，同時(shí)細(xì)胞α7 nAChR蛋白表達(dá)降低了80%(P<0.01)。結(jié)論 Anisomycin能激動(dòng)SH-SY5Y細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起α7 nAChR蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)；SB203580能阻斷SH-SY5Y細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起α7 nAChR蛋白水平顯著降低。

阿爾茨海默??；α7 nAChR；p38 MAPK

神經(jīng)型乙酰膽堿受體(nAChR)在阿爾茨海默病(AD)中研究較多，α7 nAChR是分布最廣的亞單位之一〔1〕，具有調(diào)節(jié)認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等功能〔2,3〕，膽堿能系統(tǒng)障礙和神經(jīng)損傷可能與α7 nAChR基因、結(jié)構(gòu)及其功能異常有一定關(guān)聯(lián)〔4〕。 α7 nAChR表達(dá)增加能降低Tau蛋白磷酸化水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔5〕，尼古丁作為膽堿受體興奮劑，可明顯改善認(rèn)知功能損害〔6〕，因此α7 nAChR激動(dòng)劑與其陽性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合后對AD治療有重要作用〔7〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由相關(guān)激動(dòng)的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，其中p38 MAPK參加調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞存活的整個(gè)生命過程，在神經(jīng)受損及細(xì)胞壞死中涉及較多。通過體外激動(dòng)α7 nAChR可以促進(jìn)nAChR 離子通道對Ca2+通透性，伴隨Ca2+水平升高M(jìn)APK信號(hào)系統(tǒng)中的p38通路可被激活并發(fā)揮作用〔8〕，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞受損后基因的表達(dá)。研究顯示激活p38 MAPK可引起神經(jīng)系統(tǒng)Tau過度磷酸化〔9〕。因此，本實(shí)驗(yàn)將針對AD中影響Tau蛋白磷酸化水平的α7尼古丁受體蛋白及p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路展開研究，探索二者之間的關(guān)系，為α7 nAChR調(diào)節(jié)Tau蛋白作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 源于人腦的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞由本課題組保存；DMEM培養(yǎng)基、血清、0.25%胰酶均來源于Hyclone公司；兔抗人p38 MAPK單克隆抗體(8690s)、兔抗人p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) 單克隆抗體(4511s)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(7074s)、SB203580(5633s)均購于美國Cell Signaling公司；兔抗人α7 nAChR多克隆抗體(sc-5544)購于美國Santa公司；鼠抗人β-actin 單克隆抗體(m20010)購于美國Abmart公司；辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(ZB2305)來源于中杉金橋公司；Anisomycin(A9789-25mg)源于美國Sigma公司；蛋白marker來源于美國Thermo公司；5倍蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、顯影液、定影液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)購自日本Dojindo公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物、RIPA高效裂解液均來源于北京索萊寶公司；PVDF膜、ECL-Plus發(fā)光試劑購自美國Millipoe公司；膠片購于中國柯達(dá)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 SH-SY5Y細(xì)胞以DMEM為培養(yǎng)基，其中添加10%血清、1%雙抗 (青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，放入37℃含5% CO2恒溫箱中進(jìn)行孵育。細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后接種于六孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至85%～90%時(shí)，更換未添加血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理12 h，再分別加入2 ng/ml Anisomycin〔10〕、160 μmol/L SB203580(CCK-8篩選條件)，均處理1 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8法檢測SH-SY5Y細(xì)胞活力 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將經(jīng)胰酶消化后的SH-SY5Y細(xì)胞吹打混勻成單細(xì)胞懸液，以密度為104/孔接種于96孔板中(邊緣孔用單純DMEM培養(yǎng)基填充，可作為空白孔)，每孔定容100 μl，每組6個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞生長至孔底80%～85%時(shí)，吸掉培養(yǎng)基，每孔加入DMEM培養(yǎng)液100 μl進(jìn)行饑餓處理，12 h后吸掉單純培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每組加入濃度分別為0、20、40、80、160、320和640 μmol/L的SB203580(用DMEM稀釋)，孵育1 h后吸掉培養(yǎng)基，終止藥物作用，同時(shí)周邊空白孔也吸掉原DMEM培養(yǎng)液，最后均加入含10%CCK-8的DMEM培養(yǎng)基，每孔100 μl，于恒溫箱中繼續(xù)孵育，1 h后用酶標(biāo)儀檢測各孔在540 nm處的吸光度(A)值并根據(jù)公式：細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對照組-空白組)計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 Western印跡法檢測SH-SY5Y細(xì)胞中p38、p-p38及α7 nAChR蛋白水平 細(xì)胞加藥處理后，按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑混合物=100∶1∶1配制細(xì)胞裂解液，分別收集細(xì)胞、提取蛋白質(zhì)并定量蛋白濃度；運(yùn)用Western印跡方法檢測細(xì)胞中p38、p-p38蛋白表達(dá)情況，以驗(yàn)證相應(yīng)藥物對SH-SY5Y細(xì)胞作用條件的篩選；檢測細(xì)胞中α7 nAChR蛋白表達(dá)情況，觀察藥物作用p38 MAPK通路蛋白后對α7 nAChR蛋白水平的影響。運(yùn)用Image J 軟件進(jìn)行圖片像素灰度值處理，以β-actin條帶作為內(nèi)對照，分別計(jì)算p38、p-p38、α7 nAChR蛋白條帶相對其內(nèi)參的灰度比值并作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。每組蛋白3個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度SB203580對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響 經(jīng)不同濃度的SB203580處理后，細(xì)胞活力值逐漸下降且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，在20、40和80 μmol/L SB203580作用時(shí)，細(xì)胞活力(90±2、86±12、85±6)降低，但與對照組(100±0.8)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);隨著SB203580濃度增加，細(xì)胞活力明顯下降，160、320和640 μmol/L組的細(xì)胞活力(83±7、51±7、5±1)分別是對照組的83%(P<0.05)、50%(P<0.01)和5%(P<0.01)。因?yàn)?60 μmol/L是使細(xì)胞活力下降最低即相對存活率最高的濃度，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的SB203580濃度均為160 μmol/L。

2.2 SB203580對p38 MAPK信號(hào)通路蛋白水平的影響 與對照組相比(92±8)，SB203580組p38蛋白質(zhì)水平(92±8)保持不變，p-p38蛋白質(zhì)水平降低了62%(對照組105±6，SB203580組40±7)(P<0.01)，說明160 μmol/L的SB203580作用SH-SY5Y細(xì)胞1 h后p38 MAPK通路被明顯抑制。見圖1。

圖1 SB203580對細(xì)胞p38、p-p38蛋白水平的影響

2.3 Anisomycin對p38 MAPK信號(hào)通路蛋白水平的影響 與對照組(p38:94±6,p-p38:105±9)相比，p38蛋白質(zhì)水平(93±7)保持不變，p-p38蛋白質(zhì)水平(30±8)升高了71%(P<0.01)，說明2 ng/ml的Anisomycin作用SH-SY5Y細(xì)胞1 h后p38 MAPK通路被顯著激活。見圖2。

圖2 Anisomycin對細(xì)胞p38、p-p38蛋白水平影響

2.4 p38 MAPK信號(hào)通路對α7 nAChR蛋白水平的影響 與對照組(102±7、104±11)相比，Anisomycin處理組細(xì)胞α7 nAChR蛋白水平(184±7)升高了80%(P<0.01)，SB203580處理組細(xì)胞α7 nAChR蛋白水平(20±5)降低了80%(P<0.01),說明p38 MAPK通路激活引起α7 nAChR蛋白表達(dá)升高，p38通路抑制引起α7 nAChR蛋白水平降低。見圖3。

圖3 Anisomycin及SB203580對細(xì)胞α7 nAChR蛋白水平影響

3 討 論

目前AD發(fā)病年齡逐步提前且發(fā)病率逐年上升，加快對該病的探索及有效的防治研究已迫在眉睫〔11〕。在AD的病程發(fā)展中nAChR數(shù)目明顯減少〔12,13〕，α7 nAChR是其重要組成部分，研究表明，降低α7 nAChR活力可增強(qiáng)Aβ誘導(dǎo)的膽堿系統(tǒng)紊亂及神經(jīng)毒性〔14,15〕，激活α7 nAChR不僅可以促進(jìn)神經(jīng)元興奮〔16〕，還可對抗神經(jīng)毒性，減弱Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔13〕，發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用，還能提高AD患者的認(rèn)知水平及其空間學(xué)習(xí)記憶能力〔17〕。因此，α7 nAChR激動(dòng)劑已被證實(shí)為一種前景較好的AD治療藥〔18〕。

MAPK傳導(dǎo)通路是體內(nèi)的一條基本信息傳遞鏈，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡等整個(gè)生命過程〔19〕，p38 MAPK是其重要成員。研究表明，Aβ可通過激活p38 MAPK信號(hào)途徑引起細(xì)胞凋亡〔20〕，Tau蛋白磷酸化可促進(jìn)MAPK激動(dòng)，通過細(xì)胞周期活化機(jī)制引起神經(jīng)損傷〔21〕，因此tau蛋白及Aβ引起的神經(jīng)毒性都與p38 MAPK激活存在一定聯(lián)系〔22〕，在AD的預(yù)防與治療研究中發(fā)現(xiàn)，抑制p38信號(hào)傳導(dǎo)通路可抵抗Aβ毒性〔23〕，p38 MAPK阻斷劑可能會(huì)成為治療認(rèn)知功能障礙性疾病的新靶點(diǎn)〔24〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p38 MAPK通路被阻斷時(shí)α7 nAChR蛋白表達(dá)明顯降低，可能與神經(jīng)損傷機(jī)制減少需降低保護(hù)機(jī)制以維持機(jī)體平衡有關(guān)；p38 MAPK通路被激活后α7 nAChR蛋白表達(dá)明顯升高，可增強(qiáng)機(jī)體抵抗力發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用抵抗毒性損傷。綜上所述，α7 nAChR蛋白水平可受p38 MAPK通路的影響，并與通路蛋白水平變化呈正相關(guān)，說明p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路對α7 nAChR具有非常強(qiáng)的調(diào)控作用，在尼古丁受體調(diào)節(jié)AD的機(jī)制研究中p38 MAPK可能會(huì)成為一個(gè)新的關(guān)鍵和重要突破點(diǎn)。

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〔2016-12-20修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360178)；貴州省教育廳“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”(黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心〔2014〕06)；貴州省科技廳重大專項(xiàng)(黔科合重大專項(xiàng)字2014〔6008〕)；貴州省科技廳項(xiàng)目(黔科合SY字〔2013〕3020;黔科合LH字〔2016〕7365；

李 毅(1978-)，男，中級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事老年性癡呆研究。

周 飛(1990-)，女，碩士，主要從事神經(jīng)分子生物學(xué)研究。

R749.01

A

1005-9202(2017)05-1047-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.003

1 貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室