范茜茜 董 勤 沈梅紅 李 茜 趙小文 吳錦萍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210046)

·基礎(chǔ)研究·

電針對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

范茜茜 董 勤 沈梅紅 李 茜 趙小文 吳錦萍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210046)

目的 探討電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表達(dá)的影響。方法 雄性清潔級(jí)SD大鼠72只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和電針組各24只。用改良Longa線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血模型，缺血2 h，于再灌注開始后電針組針刺“百會(huì)”和“大椎”穴。各組于缺血再灌注24 h后行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦含水量測(cè)定，免疫組化染色法檢測(cè)缺損側(cè)皮層組織Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 模型組、電針組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于假手術(shù)組(P<0.01),與模型組比較，電針組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組腦含水量明顯增高(P<0.01)，電針組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),較之模型組，電針組的腦含水量顯蓍降低(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組、電針組Bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)均顯著增多(P<0.05或P<0.01)，電針組又高于模型組(P<0.05)；較之假手術(shù)組，模型組Bax蛋白及mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.01)，電針組無明顯差異(P>0.05)，電針組較模型組顯著降低(P<0.01)；Bcl-2/Bax及Bcl-2 mRNA/Baxm RNA的比值，模型組降低而電針組升高(P<0.01)。結(jié)論 電針可以通過提升Bcl-2/Bax的比值使抗凋亡基因占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而抑制缺血再灌注區(qū)的細(xì)胞凋亡，減輕腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

電針；腦缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax

神經(jīng)細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注損傷的病理過程中起重要作用，缺血性腦卒中神經(jīng)細(xì)胞損害的重要機(jī)制，從基因分子學(xué)來看，神經(jīng)元凋亡最重要的調(diào)節(jié)者是兩個(gè)分子家族——半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族和Bcl-2蛋白家族。目前，Bcl-2和Bax在腦缺血再灌注RKM WTL 與細(xì)胞凋亡中的作用受到廣泛關(guān)注，針刺對(duì)Bcl-2家族中的Bcl-2有促進(jìn)其表達(dá)的作用，對(duì)Bax有抑制其表達(dá)的作用。本研究以此為切入點(diǎn)，結(jié)合神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦組織含水量的改變等指標(biāo)，進(jìn)一步綜合探討針刺的調(diào)控特點(diǎn)，為針刺治療缺血性腦中風(fēng)的效應(yīng)機(jī)制提供更豐富的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠72只，體重(280±20)g，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心〔許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001〕。所有大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心〔12 h/12 h晝夜節(jié)律、(22±2)℃室溫、50%～60%濕度，通風(fēng)良好〕。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，大鼠自由攝食與飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取24只為假手術(shù)組，余下動(dòng)物采用改良Longa線栓法構(gòu)建腦缺血再灌注模型。將造模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)分組，分別為再灌注24 h組(下稱模型組)，再灌注24 h+電針組(下稱電針組)，每組有效例數(shù)為24只。

1.2 主要儀器與試劑 華佗牌一次性毫針，規(guī)格0.20×13 mm2(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)、韓氏HANS-200型電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療有限公司)；石蠟切片機(jī)RM2145(德國(guó)LEICA公司)；TP1020型生物組織烘片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；熒光多功能顯微鏡BX60(日本OLYMPUS公司)；圖像分析儀(CMIAS 98A，北京航空航天大學(xué))；DP71圖像獲取系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)；核酸蛋白檢測(cè)儀(德國(guó)Eppendorf公司)；Verity 96孔板熱循環(huán)儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；PCR擴(kuò)增儀7500(美國(guó)Applied Biosystems公司)。兔抗大鼠單克隆抗體Bcl-2(ab7973)、Bax(ab32503)一抗(上海Abcam貿(mào)易有限公司)；5%BSA胎牛血清(封閉液)、生物素化羊抗兔IgG(二抗)、鏈酶親和素-生物素復(fù)合物(SABC)及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(武漢博士德生物工程有限公司)；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa生物公司)。

1.3 局灶性腦缺血模型制備 采用改良Longa線栓法制備腦缺血再灌注模型〔1〕。選擇直徑為0.28 mm的魚線，頭端加熱使其變成光滑球面(直徑約0.30 mm)，然后剪成長(zhǎng)約(60±0.5)mm線栓，用直尺將其平均分為三等分(每份約20 mm±0.5 mm)，75%的酒精清潔處理后備用。將大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后仰位固定，頸部備皮，鋪孔巾后切開皮膚，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。結(jié)扎剪斷頸外動(dòng)脈后，通過頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心殘端緩慢插入線栓,經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈，插入深度約為(18±1.5)mm，當(dāng)遇到一定阻力時(shí)立即停止插線，此時(shí)線栓頭端已到達(dá)大腦中動(dòng)脈的入口。將線栓入口處結(jié)扎固定，防止線栓脫落出血，縫合皮膚并消毒，外留1 cm線栓，將大鼠單獨(dú)仰臥在鼠籠中。大鼠缺血2 h后輕輕拔出線栓，實(shí)現(xiàn)缺血再灌注。大鼠清醒后自由飲水和攝食。所有大鼠在術(shù)前禁食12 h，但自由飲水。

1.4 各組處理方法 假手術(shù)組：除不穿入線栓外，其余操作與模型組相同。模型組：采用改良Longa線栓法制備，缺血2 h后拔出線栓，模型建立后不進(jìn)行任何干預(yù)處理。電針組：建立模型，缺血2 h后拔出線栓再灌注同時(shí)電針“百會(huì)”、“大椎”穴。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》〔2〕動(dòng)物穴位圖譜選取“百會(huì)”、“大椎”穴，用0.20 mm×13 mm的一次性不銹鋼毫針針刺，“百會(huì)”穴平刺，“大椎”穴約30°角斜刺，深度為10 mm。接韓氏HANS-200型電針儀，“百會(huì)”穴接負(fù)極，“大椎”穴接正極。刺激參數(shù)：疏密波，頻率2/15 Hz，刺激強(qiáng)度以針柄輕微顫動(dòng)，且動(dòng)物不嘶叫為宜。持續(xù)電刺激30 min。

1.5 觀測(cè)指標(biāo) 大鼠缺血2 h再灌注24 h后給予神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，然后斷頭處死，其中8只行腦組織含水量測(cè)定;8只經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌流后取腦，行免疫組化檢測(cè);另8只取損傷灶周邊組織，液氮速凍，-70℃冰箱保存，行qRT-PCR檢測(cè)。

1.5.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 腦缺血再灌注24 h后，參照J(rèn)ulio氏18分制〔3〕評(píng)分法進(jìn)行大鼠的神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)：①自發(fā)活動(dòng)(0～3分)，在大鼠籠中觀察5 min，觀察其靠近籠壁及探究環(huán)境的能力；②提尾觀察四肢運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性(0～3分)；③將大鼠置于桌子邊緣，保持后腿騰空，觀察兩前肢運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性(0～3分)；④觀察攀爬能力，提尾拉下時(shí)感受其攀附力(1～3)；⑤本體感覺(1～3)，用鈍棒觸摸其兩側(cè)，觀察其對(duì)刺激的反應(yīng)；⑥觸須反應(yīng)(1～3)，從動(dòng)物后面用鈍棒觸胡須，觀察其反應(yīng)，6項(xiàng)評(píng)分相加為總積分，評(píng)分范圍3～18分，18分為正常。

1.5.2 腦含水量測(cè)定 采用干濕重稱量法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物再灌注24 h后斷頭取腦，用濾紙吸盡表面血漬后，去除嗅球、小腦和低位腦干，銳性刀片分離左右半球，將損傷側(cè)半球的腦組織用電子分析天平稱其濕重后，置于105℃恒溫干燥箱內(nèi)持續(xù)干燥24 h后稱其干重，按照公式：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，計(jì)算腦組織含水量。

1.5.3 缺損側(cè)大腦皮層Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 采用免疫組化法檢測(cè)。大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)左心室依次使用0.9%氯化鈉鹽溶液250 ml和250 ml 4%多聚甲醛溶液灌注固定到大鼠身體發(fā)僵后，迅速斷頭取出腦組織標(biāo)本。腦組織標(biāo)本保存于4℃的10%中性甲醛溶液中。24 h后依次從低濃度到高濃度的乙醇溶液中逐漸脫去腦組織中的水分，并使用二甲苯透明，最后石蠟包埋。在大鼠缺損側(cè)大腦半球距離嗅球尖端7～11 mm處連續(xù)切取約6 μm厚腦組織切片，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，滴加Bcl-2、Bax一抗，按試劑盒說明常規(guī)SABC法對(duì)切片標(biāo)本進(jìn)行染色，DAB顯色，蒸餾水洗、脫水、透明、封片。染色結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞為黃色或黃棕色。將已染好的切片放在熒光多功能顯微鏡40×10倍視野下隨機(jī)選擇不重疊缺損側(cè)頂顳區(qū)皮層的5個(gè)視野觀察Bcl-2、Bax的陽(yáng)性表達(dá)，用圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度值(IOD)，所得數(shù)據(jù)取其均值。

1.5.4 缺損側(cè)大腦皮層Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá) 采用qRT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。大鼠缺血再灌注24 h后，在冰盤上迅速分離梗死側(cè)皮層，經(jīng)液氮包埋速凍。置于-80℃低溫冰箱中保存。經(jīng)總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性2 min；95℃ 變性15 s，55℃退火延伸35 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。55℃ 35 s讀取熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分的影響 腦缺血再灌注24 h后，模型組〔(9.25±1.71)分〕、電針組〔(12.00±1.58)分〕神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于假手術(shù)組〔(15.10±1.52)分〕(均P<0.01)；與模型組比較，電針組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高(P<0.05)。

2.2 電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦含水量的影響 與假手術(shù)組〔(79.49±0.94)%〕比較，再灌注24 h后模型組腦含水量〔(81.88±1.84)%〕明顯增高(P<0.01)，而電針組〔(79.75±1.11)%〕與假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，電針組的腦含水量顯著降低(P<0.01)。

2.3 電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組、電針組再灌注24 h后Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著增多(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，電針組水平升高(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組Bax蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.01)，而電針組略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，電針組Bax蛋白表達(dá)較低(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2/Bax蛋白比值降低，電針組比值升高(P<0.01)，電針組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠大腦皮層組織Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

2.5 電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組、電針組Bcl-2 mRNA表達(dá)均顯著增多(P<0.05和P<0.01)；與模型組比較，電針組Bcl-2 mRNA表達(dá)略有升高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組Bax mRNA的表達(dá)明顯上升(P<0.05)，而電針組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，電針組Bax mRNA的表達(dá)降低(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2/Bax mRNA的比值降低，而電針組比值升高(P<0.05和P<0.01)；電針組與模型組比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠皮層組織Bcl-2 mRNA、 Bax mRNA表達(dá)的變化

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的內(nèi)部因子很多，而Bcl-2家族相關(guān)基因是腦缺血神經(jīng)元凋亡調(diào)控基因的重要組成部分。目前已知的凋亡調(diào)節(jié)蛋白中Bcl-2家族在各類刺激信號(hào)引起的凋亡中起到關(guān)鍵的作用〔4〕。Bcl-2蛋白家族包括兩類功能相反的基因，一類是抑制細(xì)胞凋亡的基因，以 Bcl-2為代表；另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以Bax為代表，它與Bcl-2具有較高的同源性，可以拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

腦缺血損傷后傷側(cè)大腦廣泛存在凋亡現(xiàn)象，以皮層及海馬為甚,大腦皮層是創(chuàng)傷損傷部位,神經(jīng)元對(duì)外源刺激因素較敏感,可發(fā)生細(xì)胞壞死〔5〕。楊云華等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2、Bax基因在傷腦表達(dá)增高，其增高的時(shí)相與凋亡規(guī)律相似，表達(dá)與細(xì)胞凋亡發(fā)生呈正相關(guān)。說明在傷后的大腦中，Bcl-2、Bax基因處于矛盾的交爭(zhēng)中，當(dāng)Bax誘導(dǎo)腦細(xì)胞調(diào)亡時(shí)，大腦的自我修復(fù)系統(tǒng)同時(shí)啟動(dòng)Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡途徑，最大可能減輕腦神經(jīng)元的損害。Bax和Bc1-2表達(dá)比率是決定細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生凋亡的重要因素。韓英等〔6〕實(shí)驗(yàn)中觀察到，Bax在腦缺血損傷再灌注時(shí)表達(dá)增加，與Bcl-2形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)在鄰近半暗帶生存神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)的上調(diào)反映了一種保護(hù)作用，但缺血再灌注組Bcl-2/Bax比值降低，終致凋亡細(xì)胞增加?？梢?，二者表達(dá)的相對(duì)水平高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)。

針刺能明顯提高Bcl-2 表達(dá)，同時(shí)降低Bax 表達(dá)。如陶靜等〔7〕于腦缺血再灌注2 h后開始電針患側(cè)“曲池”、“足三里”穴，24 h后檢測(cè)表明，Bcl-2 表達(dá)增高，Bax 表達(dá)下降，從而對(duì)抗腦缺血再灌注損傷所致的細(xì)胞凋亡起到抗凋亡的腦保護(hù)作用。何娜等〔8〕觀察大鼠腦缺血再灌注模型建立后針刺外關(guān)、足三里后細(xì)胞凋亡蛋白的變化，針刺組Bcl-2的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，Bax的表達(dá)與假手術(shù)組基本相似，證明針刺治療腦梗死可升高Bcl-2和降低Bax的表達(dá)，從而抑制腦細(xì)胞的凋亡，改善神經(jīng)功能。

本研究結(jié)果顯示，在腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2蛋白與Bax 蛋白二者表達(dá)的平衡結(jié)果決定細(xì)胞存活或死亡，電針可以通過調(diào)控內(nèi)源性凋亡途徑促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2的作用，抑制Bax的促凋亡作用，但并非單純表現(xiàn)為升高Bcl-2或降低Bax的絕對(duì)值，關(guān)鍵在于提升Bcl-2/Bax的比值，使抗凋亡基因占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而達(dá)到降低缺血再灌注區(qū)的細(xì)胞凋亡、減輕腦水腫、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的目的。

1 李忠仁,崔 龍.“TC”指數(shù)在改良LONGA線栓法局灶性腦缺血/再灌流動(dòng)物模型制備中的應(yīng)用〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006;26(91):18-20.

2 余曙光，徐 斌.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012:277.

3 Garcia JH,Wagner S,Liu KF,etal.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats〔J〕.Stroke,1995;26(4):627-35.

4 Babu PP,Suzuki G,Ono Y,etal.Attenuation of ischemia and/or reperfusion injury during myocardial infarction using mild hypothermia in rats:an immunohistochemical study of Bcl-2,Bax,Bak and TUNEL〔J〕.Pathol Int,2004;54(12):896-903.

5 楊云華,張可成,張藝梅.大鼠腦創(chuàng)傷細(xì)胞凋亡和Bcl-2基因家族表達(dá)的變化〔J〕.西南國(guó)防醫(yī)藥,2009;19(5):488-91.

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7 陶 靜,陳阿貞,蘭 嵐,等.電針對(duì)大鼠早期局灶性腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究〔J〕.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2014;29(1):3-8.

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〔2016-06-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

Influence of electroacupuncture on the expression of apoptosis related genes Bcl-2 and Bax in rats with cerebral ischemia reperfusion injury

FAN Qian-Qian,DONG Qin,SHEN Mei-Hong,etal.

The Second Clinical Medical College of Nan Jing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,Jiangsu,China

Objective To observe the influence of electroacupuncture(EA) on the expression of apoptosis related protein Bcl-2,Bax and mRNA in rats with cerebral ischemia and reperfusion.Methods The male 72 grade clean SD rats,using the random number table method ,were divided into sham operation, model and EA groups with 24 rats in each group.The right middle cerebral artery occlusion models were induced by modified Longa suture method,and 2 hours later,EA group after reperfusion was given acupuncture "Baihui" and "Dazhui".The neurological behavior score and brain water content were measured by 24 hours after ischemia and reperfusion. The immunohistochemical staining method was used to detect defects of lateral cortex tissue Bcl-2, Bax protein expression. qRT-PCR was used to detect the changes of Bax and Bcl-2 mRNA expressions.Results The scores of neurological behavior in EA and model groups were lower than those in the sham operation group(P<0.01);Compared with that of model group,the neurological behavior score of EA group was increased(P<0.05).Compared with that of sham operation group,the brain water content was significantly increased in model group (P<0.01);However,there was no significant difference in EA group(P>0.05); Compared with that of model group, the brain water content of EA group was decreased noticeable(P<0.01). Compared with those of sham operation and model groups, the expressions of Bcl-2 protein and mRNA of EA group were significantly increased(P<0.05 orP<0.01), the expressions of Bax protein and mRNA Bax of model group were significantly increased(P<0.01). The ratio of Bcl-2 mRNA/Bax mRNA and Bcl-2/Bax of model group were decreased and those of EA group were increased(P<0.01).Conclusions EA could improve the ratio of Bcl-2/Bax to take advantage of the anti apoptotic gene and to inhibit the cell apoptosis, reduce the brain edema and promote the recovery of neural function.

EA;Cerebral ischemia reperfusion;Apoptosis;Bcl-2 gene;Bax gene

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373748)

董 勤(1961-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事針灸臨床研究。 沈梅紅(1970-)，女，碩士生導(dǎo)師，主要從事針灸實(shí)驗(yàn)研究。

范茜茜(1991-)，女，碩士，主要從事電針對(duì)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用的凋亡機(jī)制研究。

R245

A

1005-9202(2017)05-1041-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.001