羅 莉 唐東昕 王鏡輝 郭 斌 李 軍 黃雯琪 張 蘭 王雅杰

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433)

核呼吸因子1表達(dá)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展、臨床病理特征及Ki-67表達(dá)的關(guān)系

羅 莉 唐東昕1王鏡輝1郭 斌1李 軍1黃雯琪1張 蘭1王雅杰

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433)

目的 探討核呼吸因子(NRF)-1在乳腺癌組織中的表達(dá)及與患者臨床病理特征、Ki-67表達(dá)的關(guān)系。方法 選取手術(shù)切除后經(jīng)病理學(xué)證實為乳腺癌的117例患者的癌組織標(biāo)本(乳腺癌組)、60例乳腺良性疾病患者的乳腺組織(良性組)，分別采用EnVision染色法進(jìn)行檢測，觀察兩組標(biāo)本中NRF-1蛋白、Ki-67蛋白的表達(dá)及二者相關(guān)性。結(jié)果 乳腺癌組織中的NRF-1陽性表達(dá)率(76.07%)顯著低于良性組(100.00%)(P<0.05)，Ki-67陽性表達(dá)率(79.49%)顯著高于良性組(20.00%)(P<0.05)。 乳腺癌組織中的NRF-1陽性表達(dá)與組織學(xué)分級、TNM分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的關(guān)系(P<0.05)。乳腺癌組織中的NRF-1與Ki-67蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.868，P<0.001)。結(jié)論 乳腺癌患者的NRF-1、Ki-67表達(dá)發(fā)生異常，NRF-1表達(dá)與患者的臨床病理特征、Ki-67表達(dá)具有顯著的相關(guān)性。

核呼吸因子；乳腺癌

乳腺癌特別是侵襲性乳癌嚴(yán)重威脅了女性的生命健康，包括炎性乳癌在內(nèi)的惡性程度較高的腫瘤往往較早出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移。雖然臨床上通過根治性乳腺切除聯(lián)合淋巴結(jié)清掃可以在一定程度上延長術(shù)后中位生存時間，但總體治療效果仍然不佳。多數(shù)患者臨床確診乳腺癌已出現(xiàn)明顯的腋窩淋巴結(jié)或者胸骨旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響了患者臨床預(yù)后〔1〕。近年來對于乳腺癌的相關(guān)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵襲等淋巴特征的研究逐漸轉(zhuǎn)向基因水平的差異性探討。有研究表明乳腺癌組織細(xì)胞有氧氧化明顯降低，而糖酵解途徑等無氧代謝比例明顯增加〔2〕，線粒體能量代謝的平衡和調(diào)控參與到了乳腺癌細(xì)胞能量代謝的平衡維持過程。核呼吸因子(NRF)-1近年來被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，并可能參與到了線粒體能量代謝調(diào)控中〔3〕。本文旨在探討NRF-1在乳腺癌組織中的表達(dá)及與患者的臨床病理特征、Ki-67表達(dá)的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取手術(shù)切除后經(jīng)病理學(xué)證實為乳腺癌的117例患者的癌組織標(biāo)本(乳腺癌組)、60例乳腺良性疾病患者的乳腺組織(良性組)。乳腺癌組117例，年齡35～68〔平均(52.4±9.5)〕歲，腫瘤部位：右側(cè)58例、左側(cè)59例，腫瘤最大徑：≤2 cm 46例、>2 cm 71例；浸潤性導(dǎo)管癌72例、非浸潤性導(dǎo)管癌45例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期56例，Ⅲ+Ⅳ期61例。良性組60例，年齡28～70歲，平均(54.1±9.0)歲，其中乳腺纖維瘤30例、腺瘤16例、腺病14例。兩組研究對象的年齡構(gòu)成無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有乳腺癌組織均來源于本院甲乳腺外科手術(shù)后病理學(xué)檢查證實為乳腺癌的患者，乳腺良性疾病來源于活組織病檢或手術(shù)切除后；(2)兩組患者手術(shù)前均未接受放療、化療等治療；(3)所有納入乳腺癌患者的臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤患者；(2)合并其他部位腫瘤疾病的患者；(3)研究所需相關(guān)資料不全的患者。

1.2 免疫組化方法及結(jié)果判定

1.2.1 免疫組化方法 石蠟切片脫蠟和水化后，高壓鍋抗原修復(fù)，每張切片滴加l滴3%過氧化氫溶液,室溫下孵育。每張切片滴加1滴NRF-1抗體37℃孵育60 min，每張切片滴加1滴二抗,室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。EnVisino試劑盒為Zymde公司產(chǎn)品。兔抗NRF-1多克隆抗體購自Santa Cruz公司,按照NRF-l抗體說明書要求，以正常腎小球作為陽勝對照,磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對照。Ki-67抗體購自福州邁新公司,用已知的Ki-67胃癌切片作為陽性對照,PBS替代一抗作為陰性對照。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 NRF-1蛋白、Ki-67蛋白的陽性著色表達(dá)于細(xì)胞核，呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)，(1)根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色；(2)根據(jù)陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例<10%為1分、陽性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分、陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分、陽性細(xì)胞數(shù)所占比例>75%為4分，兩種積分相乘總分<3分為陰性、≥3分為陽性。(-)為總分<3分，陰性表達(dá)；(+)為3～5分，弱陽性表達(dá)；()為6～9分，中陽性表達(dá)；()為>9分，強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS9.0軟件，組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析法。

2 結(jié) 果

2.1 兩種乳腺組織中的NRF-1和Ki-67蛋白表達(dá)情況 乳腺癌組織中的NRF-1陽性表達(dá)率(76.07%)顯著低于良性組(100.00%，P<0.05)，Ki-67陽性表達(dá)率(79.49%)顯著高于良性組(20.00%，P<0.05)。見圖1，圖2。

圖1 NRF-1蛋白在乳腺癌和乳腺 良性組織中的表達(dá)(SP，×400)

圖2 Ki-67蛋白在乳腺癌和乳腺良性組織中的表達(dá)(SP，×400)

2.2 乳腺癌組織中的NRF-1蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中的NRF-1陽性表達(dá)與乳腺癌患者的組織學(xué)分級、TNM分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的關(guān)系(P<0.05)。見表1。

2.3 乳腺癌組織中的NRF-1與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析 乳腺癌組織中的NRF-1與Ki-67蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.868，P<0.001)。

表1 乳腺癌組織中的NRF-1蛋白表達(dá)與 患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

惡性腫瘤細(xì)胞中線粒體基因異常擴(kuò)增，導(dǎo)致線粒體內(nèi)有氧氧化過程與糖酵解途徑過程比例顯著改變，糖酵解過程產(chǎn)生的三磷酸腺苷(ATP)增加。有研究表明，線粒體能量代謝平衡的紊亂參與到了惡性上皮性腫瘤的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和免疫逃逸。線粒體自身基因以及細(xì)胞核相關(guān)轉(zhuǎn)移調(diào)控基因均參與到了這一過程，而近年來基礎(chǔ)研究重點關(guān)注了NRF-1異常擴(kuò)增導(dǎo)致的線粒體能量代謝紊亂。NRF-1最早發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞色素C表達(dá)的激活轉(zhuǎn)錄因子，后來發(fā)現(xiàn)NRF-1不僅轉(zhuǎn)錄調(diào)控mTtFA的表達(dá),而且也轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)許多核編碼線粒體呼吸功能所需要的基因,包括乳酸脫氫酶、硫加氧酶、二磷酸腺苷以及脫氨基轉(zhuǎn)移酶等〔4〕。腫瘤細(xì)胞氧化呼吸鏈產(chǎn)生的能力通過鐵硫蛋白傳遞電子產(chǎn)生ATP，研究表明NRF-1顯著影響了肝癌、結(jié)腸癌以及部分膀胱移行細(xì)胞癌中鐵硫蛋白傳遞電子產(chǎn)生ATP的偶聯(lián)過程，抑制了ATP的產(chǎn)生，并促進(jìn)無氧氧化過程，導(dǎo)致體內(nèi)酸性代謝毒物增多〔5〕。腫瘤細(xì)胞能量代謝紊亂將進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖、淋巴結(jié)侵襲破壞和局部轉(zhuǎn)移等過程。

NRF-1作為細(xì)胞核呼吸因子，在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，組織學(xué)染色可見乳腺癌組織中的NRF-1陽性表達(dá)率明顯高于正常對照乳腺組織，EnVision染色可見NRF-1主要定位于細(xì)胞核周邊，染色較為均一，且均呈現(xiàn)出一致性高強(qiáng)度染色。NRF-1在乳腺癌中的高表達(dá)提示了其可能參與了乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程，NRF-1對于下游HES轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞核內(nèi)第二信使鈣離子結(jié)合蛋白等的調(diào)節(jié)作用，可以平衡異常線粒體基因突變導(dǎo)致的氧化磷酸化或者偶聯(lián)磷酸化過程障礙〔6〕，改善線粒體有氧氧化產(chǎn)能，從而調(diào)控細(xì)胞增殖〔7〕。有研究表明，NRF-1在結(jié)腸癌以及肝癌中的異常表達(dá)與癌組織的局部侵襲、黏膜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其對于乳腺癌的研究較少。本研究提示NRF-1與乳腺癌的惡性相關(guān)臨床特征具有負(fù)性關(guān)聯(lián)。隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增多、局部侵襲的加深等病理過程，NRF-1對于細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控作用降低，NRF-1表達(dá)陽性率下降。Spearman等級分析也進(jìn)一步確認(rèn)了NRF-1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。但本研究并未發(fā)現(xiàn)不同大小的癌組織與NRF-1的關(guān)聯(lián)，考慮NRF-1主要與細(xì)胞層面增殖、基因異常擴(kuò)增有關(guān)，而與大體組織學(xué)類型無明顯關(guān)聯(lián)。提示了NRF-1可以作為乳腺癌術(shù)后遠(yuǎn)期預(yù)后的潛在參考指標(biāo)。Ki-67表達(dá)出現(xiàn)于除G0、G1期早期以外的細(xì)胞周期中,在G2、M期表達(dá)最強(qiáng),被認(rèn)為是較理想反映細(xì)胞群體增殖活性的客觀指標(biāo)。本研究也提示Ki-67與NRF-1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有完全不同的作用機(jī)制。需要注意的是，部分學(xué)者認(rèn)為乳腺導(dǎo)管癌與乳腺小葉癌中NRF-1的表達(dá)以及相關(guān)作用機(jī)制并不相同〔8〕。

1 張海洋，馮慕華，徐 彤，等.人核呼吸因子2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報：綜合版,2014;13(2):37-42.

2 單系金，張景華，李玉鳳，等.線粒體融合蛋白2及Ras-MAP K信號通路與乳腺癌的研究進(jìn)展〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志,2014;9(4):371-4.

3 范 華,汪 湍,宿向東,等.SIAH2蛋白表達(dá)對評估乳腺癌患者預(yù)后的臨床意義〔J〕.中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版),2016;8(8):76-9.

4 鐵 劍，解云濤，徐 曄，等.p53基因codon 72多態(tài)性與乳腺癌術(shù)后放化療療效相關(guān)性分析〔J〕.中國腫瘤臨床,2015;42(3):152-6.

5 李鍇男，赫 軍，畢經(jīng)旺，等.核呼吸因子-1和Ki-67在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義〔J〕.中國腫瘤臨床,2011;38(19):1187-91.

6 Bahat A,Perlberg S,Melamed-Book N,etal.Transcriptional activation of LON Gene by a new form of mitochondrial stress:A role for the nuclear respiratory factor 2 in StAR overload response (SOR)〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2015;408(1):62-72.

7 Satterstrom FK,Swindell WR,Laurent G,etal.Nuclear respiratory factor 2 induces SIRT3 expression〔J〕.Aging Cell,2015;14(5):818-25.

8 Ivanova MM,Luken KH,Zimmer AS,etal.Tamoxifen increases nuclear respiratory factor 1 transcription by activating estrogen receptor beta and AP-1 recruitment to adjacent promoter binding sites〔J〕.FASEB J,2011;25(4):1402-16.

〔2016-12-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

Relationship between NRF-1 expression and breast cancer development,clinical pathology and the expression of Ki-67

LUO Li,TANG Dong-Xin,WANG Jing-Hui,etal.

The Second Military Medical University of PLA,Shanghai 200433,China

Objective To research and analyze the expression of nuclear respiratory factor (NRF)-1 in breast cancer tissue and the relationship between the expression of NRF-1 and clinicopathologic features of patients and Ki-67 expression.Methods Cancer tissue from 117 patients confirmed by pathology after surgery (breast cancer group) and benign breast tissue from 60 cases of benign breast diseases (benign group) were chosen and detected by EnVision staining. The expressions of NRF-1 and Ki-67 protein and the correlation were observed.Results The positive expression rate of NRF-1 in breast cancer (76.07%) was significantly lower than that in benign group (100%,P<0.05),and the positive expression rate of Ki-67 in breast cancer was significantly higher than that in benign group (20%,P<0.05). The positive expression of NRF-1 in breast cancer tissues was significantly related to the histological grade,TNM staging and lymph node metastasis in breast cancer patients(P<0.05). The expression of NRF-1 and Ki-67 protein in breast cancer tissues were significantly negative correlated (r=-0.868,P<0.001). Conclusions The expressions of Ki-67 and NRF-1 in patients with breast cancer are abnormal.The expression of NRF-1 is significantly correlated with the clinicopathologic features of patients and Ki-67 expression.

Nuclear respiratory factor;Breast cancer

國家自然科學(xué)基金(8156150433)；貴州省研究生工作站計劃(黔教研合JYSZ字〔2014〕018)；貴州省科技支撐計劃社會發(fā)展攻關(guān)項目(黔科合SY字〔2013〕3026號)；貴州省科學(xué)技術(shù)廳-貴陽中醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金項目(黔科合LH字〔2014〕7339號)

王雅杰(1963-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事三陰乳腺癌、消化道腫瘤及癌痛的規(guī)范化治療研究。

羅 莉(1977-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥防治腫瘤的基礎(chǔ)及臨床研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0901-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.052

1 貴陽中醫(yī)學(xué)院