傅明捷 王衍慧 李 靜 傅君舟 黃玉宇 黃 萍 趙路寧

(廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東 廣州 510180)

老年糖尿病腎病患者血漿差異蛋白的表達

傅明捷 王衍慧 李 靜 傅君舟 黃玉宇 黃 萍 趙路寧1

(廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東 廣州 510180)

目的 探討老年糖尿病腎病(DN)與健康人群血漿差異蛋白的表達。方法 選取老年DN患者10例(試驗組)，同期查體健康人群10例(對照組)，采用熒光差異雙向凝膠電泳(2D-DIGE)檢測老年DN患者及健康志愿者血漿蛋白質組的表達情況，以差異表達1.5倍為截斷值挑選蛋白質斑點并行質譜分析。結果 應用老年DN患者及健康志愿者血漿成功構建差異表達雙向凝膠電泳圖譜，并分析篩選出33個差異表達斑點，通過質譜分析數(shù)據(jù)庫比對鑒定出6種差異表達蛋白。結論 2D-DIGE技術可有效篩選老年DN相關特異蛋白，為進一步篩選DN血清標志物提供依據(jù)。

糖尿病腎??；血漿蛋白；蛋白質組

糖尿病腎病(DN)為糖尿病(DM)最常見并發(fā)癥，已成為我國面臨的嚴重公共衛(wèi)生問題〔1，2〕。本研究擬用DN患者與健康人群血清蛋白為研究材料，采用熒光差異雙向凝膠電泳(2D-DIGE)技術與基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術相結合，進行動態(tài)蛋白質組學研究分析，篩選出DN特異表達的蛋白，并對感興趣的蛋白進行生物功能的鑒定，從分子角度闡明DN的生物學基礎和機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年10月至2014年5月廣州市第一人民醫(yī)院老年病科住院的老年DN患者10例(試驗組)，男8例，女2例；年齡60～80歲。同一時間內健康志愿者10例(對照組)男8例，女2例；年齡60～80歲。兩組患者年齡及性別完全匹配。納入標準：患者24 h尿蛋白排出>500 mg；年齡60～80歲；血肌酐≤140 μmol/L；知情同意者。排除標準：腎小球濾過率<30%；血肌酐>140 μmol/L；心衰患者、人獲得性免疫缺陷病毒(HIV)陽性者、孕產婦。

1.2 主要試劑與儀器 過硫酸銨；二硫蘇糖醇(DTT)；血清去高分度蛋白試劑盒；超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；等電聚焦儀。

1.3 方法 血清的采集及處理：清晨空腹抽取上述兩組患者靜脈血10 ml，速凍存于液氮中，再置于-70℃保存，備雙向電泳及質譜分析用。雙向電泳及質譜分析 提取兩組人員血清總蛋白，用2D Quant Kit蛋白質定量試劑盒測定總蛋白濃度。每組取25 μg充分混合(內參)，50 μg內參用400 pmol Cy2標記，分別Cy3和Cy5標記，避光置于冰上放置半小時，再加1 μl亮氨酸(10 mmol/L)中止反應10 min。上樣，30 V水化13 h，然后經過100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h，8 000 V等電聚焦8.5 h。最后對膠條進行掃描并獲取清晰的圖像用于后處理分析。首先對獲得的圖像結果應用ImageMaster 5.0進行圖像分析處理，并獲得數(shù)據(jù)，進而采用Graphpad5.0軟件進行相關數(shù)據(jù)處理。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

以健康人為參照，DN患者上調或下調1.5倍為截斷值，同時滿足P<0.05的差異斑點有33個。軟件檢測對獲得的結果選定12個挖點進行膠內酶切，并行質譜分析，經檢索相關數(shù)據(jù)庫，比對鑒定出6種蛋白質，見表1。其中血清甲狀腺素運載蛋白和血液結合素和匹配率最高，分別為49%和20%。血液結合素(B28)及血清甲狀腺素運載蛋白(A41)肽指紋圖譜見圖1。

表1 篩選出的差異表達蛋白

圖1 肽指紋圖譜

3 討 論

DN血清蛋白質組學方面的研究也取得了一定的進展，可以在一定程度上彌補腎組織和尿液蛋白質組學研究的局限性〔3，4〕。Kim等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)細胞外谷胱甘肽過氧化物酶和載脂蛋白E在微量白蛋白尿(MA)和慢性腎衰竭(CRF)組血清中的表達進行性減少，可以作為2型DN的生物標志物。Overgaard等〔6〕利用SELDI-TOF-MS研究了單純1型糖尿病、1型糖尿病伴微白蛋白尿、1型糖尿病伴大量白蛋白尿三組患者的血清蛋白表達譜變化。發(fā)現(xiàn)三組Apo A1的表達水平均下調，其中第三組的下降最為顯著。Apo C1在三組的表達水平均下調，其中第三組的下降具有顯著差異(P=0.012)。transthyretin和cystatin C在第三組的表達水平較其他組均有顯著差異(P<0.000 1)，但第一、第二組間表達水平無顯著差異。因此，血清Apo A1、Apo C1、transthyretin和cystatin C的表達變化可輔助評估1型糖尿病的腎臟病變程度。以上DN蛋白質組學研究取得了很多進展與突破，初步揭示了DN的部分分子機制，發(fā)現(xiàn)了一些與DN相關的蛋白，但這些研究仍然存在不同程度的缺陷與不足：①大部分研究在結果分析時僅采用t檢驗，由于重復比較次數(shù)太多，極大地增加了犯1類錯誤的概率，使得結果的可靠性較差。②缺乏動態(tài)研究，DN的發(fā)展進程中，蛋白質表達是一個高度動態(tài)變化的過程，單一個時間點的研究無法獲得系統(tǒng)全面的蛋白變化信息。③某些蛋白質組學研究的分辨率太低，導致發(fā)現(xiàn)有意義差異蛋白的概率也大大降低，如高糖環(huán)境下的系膜細胞研究，雖然采用了亞蛋白質組學方法也只獲得了214個蛋白〔7，8〕。本研究采用血漿蛋白質組學技術，應用熒光差異雙向凝膠電泳初步篩選出了老年DN患者與正常人群差異表達的血漿蛋白，為下一步進行的前瞻性大規(guī)模臨床對照研究提供了一定的理論和實踐依據(jù)。下一步有望通過Western技術在較大人群中進行驗證，并確定DN的特異性血漿蛋白標志物。

1 郭曉蕙，樓青青.我國糖尿病教育的問題與思考〔J〕.中華內科雜志，2011；50(1)：6-7.

2 Parving HH，Lewis JB，Ravid M，etal.Prevalence and risk factors for microalbuminuria in a referred cohort of type 2 diabetic patients：a global perspective〔J〕.Kidney Int，2006；69(11)：2057-63.

3 Sharma V，Tikoo K.Stage-specific quantitative changes in renal and urinary proteome during the progression and development of streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats〔J〕.Mol Cell Biochem，2014；388(1-2)：95-111.

4 Zubiri I，Posada-Ayala M，Sanz-Maroto A，etal.Diabetic nephropathy induces changes in the proteome of human urinary exosomes as revealed by label-free comparative analysis〔J〕.J Proteomics，2014；96(2)：92-102.

5 Kim HJ，Cho EH，Yoo JH，etal.Proteome analysis of serum from type 2 diabetics with nephropathy〔J〕.J Proteome Res，2007；6(2)：735-43.

6 Overgaard AJ，Hansen HG，Lajer M，etal.Plasma proteome analysis of patients with type 1 diabetes with diabetic nephropathy〔J〕.Proteome Sci，2010；8(1)：4.

7 Blutke A.Opening a treasure chest：glomerular proteome analyses of formalin-fixed paraffin-embedded kidney tissue in the investigation of diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2012；27(5)：1695-8.

8 Papale M，Di PS，Magistroni R，etal.Urine proteome analysis may allow noninvasive differential diagnosis of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Care，2010；33(11)：2409-15.

〔2015-09-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

廣東省科技廳項目(2012B031800329)

黃 萍(1961-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年糖尿病研究。

傅明捷(1964-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年糖尿病及其并發(fā)癥研究。

R589.1

A

1005-9202(2017)04-0892-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.048

1 廣州醫(yī)科大學實驗醫(yī)學研究中心