韋家俊 李 浩 廖小明 吳 嵐 王耀輝 劉開祥

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

肢體缺血后處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠 Caspase-3 和細胞凋亡的影響

韋家俊 李 浩 廖小明 吳 嵐 王耀輝 劉開祥

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

目的 探討肢體缺血后處理(Lpost)對大鼠局灶性腦缺血再灌注區(qū)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3和細胞凋亡的影響。方法 健康雄性SD大鼠36只，隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、肢體缺血后處理組(Lpost組)，I/R組、Lpost組均行缺血2 h再灌注24 h局灶性腦缺血再灌注模型。Lpost組再灌注前實施肢體缺血后處理(缺血15 min，灌注15 min)3個循環(huán)。各組大鼠神經(jīng)功能評分，采用四氮唑紅(TTC) 染色確定腦缺血半暗帶位置，TUNEL 測定細胞凋亡，免疫組化測定 Caspase-3 的表達變化。結(jié)果 Sham組神經(jīng)缺損評分為 0 分；與 Lpost 組(1.20 ± 0.41)比較，I/R 組神經(jīng)功能缺損較重(2.40±0.51，P<0.05)；TTC 染色證實缺血半暗帶位于大腦矢狀裂至外側(cè)裂上1/3的皮質(zhì)組織。與Sham組相比，I/R組、Lpost 組缺血半暗帶內(nèi)凋亡細胞數(shù)、Caspase-3表達均明顯增加(P< 0.05)，且I/R組表達明顯增強，高于Lpost組(P<0.05)。結(jié)論 肢體Lpost可減輕腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡，緩解神經(jīng)細胞的壞死，其作用機制可能與減少 Caspase-3 表達有關(guān)。

缺血再灌注；肢體缺血后處理；細胞凋亡；半胱氨酸蛋白酶-3

肢體缺血后處理(Lpost)是近年來發(fā)現(xiàn)的可以減少腦缺血再灌注損傷的方法。以往研究證實〔1〕，Lpost 可以減少腦缺血再灌注后的腦梗死體積，但其調(diào)節(jié)機制尚不十分清楚。本實驗參照 Zea Longa 線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，通過觀察 Lpost 對半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3和細胞凋亡的影響，探討 Lpost 減少腦缺血再灌注損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 TUNEL 法細胞凋亡檢測試驗盒購于羅氏公司、DAB顯色試劑盒及Caspase-3兔多克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 實驗動物分組 SPF 級雄性SD大鼠36只(體質(zhì)量240～260 g)，由廣西醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心提供。隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、肢體缺血后處理組(Lpost組)，I/R 組、Lpost 組均行缺血 2 h再灌注 24 h 局灶性腦缺血再灌注模型。Lpost組阻斷大腦中動脈2 h后，于再灌注時夾閉雙下肢動脈15 min，松開15 min，反復(fù)3次。

1.3 局灶性腦缺血再灌注模型的制備 采用改良的MCAO模型制備方法〔2〕，步驟如下：大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg i.p.)麻醉，取頸部左旁正中切口3～4 cm，分離左側(cè)頸總動脈(CCa)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，雙極電凝器凝斷 ECA 及其分支，用動脈夾夾閉 ICA、CCA 近心端，在ECA分叉遠心端用眼科剪斜行剪一倒“V”小口并導(dǎo)入栓線，栓線自左ECA 插入CCA分叉處，固定線栓、調(diào)整方向，將線栓插入左ICA，松開動脈夾，緩慢推進，稍感阻力即止，此時插入深度約為18～19 mm。缺血120 min抽出線栓完成MCAO/R模型。Sham組：不做腦缺血，栓線插入深度<9 mm。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分 大鼠腦缺血2 h 再灌注24 h，進行神經(jīng)功能缺損評分。參照Longa 等〔3〕神經(jīng)功能缺損評分標準：無神經(jīng)功能缺損為0分；病灶對側(cè)前肢不能完全伸直為1分；行走向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分；身體向癱瘓側(cè)跌倒為3分；出現(xiàn)意識障礙為4分。神經(jīng)功能缺損達1～3分者視為模型制作成功。

1.5 腦梗死體積測定 缺血2 h再灌注24 h，各組隨機取6只大鼠，過度麻醉后取腦，-4℃ 冷藏10 min，冠狀切面切成均勻的5片，每片約3 mm，置于2% TTC溶液避光溫育、多聚甲醛液固定。梗死灶區(qū)呈白色，正常呈紅色。利用CAD處理軟件，計算出各缺血側(cè)的總體積和梗死區(qū)的體積，再求梗死區(qū)占半球總體積的百分比。

1.6 TUNEL染色及Caspase-3染色 缺血2 h再灌注24 h，各組隨機取6只大鼠，用10%水合氯醛對大鼠進行麻醉。夾閉腹主動脈，用4℃生理鹽水經(jīng)左心室穿刺灌注，待右心耳充盈后將其剪開，灌注約100 ml后，再用4%多聚甲醛磷酸緩沖液200～300 ml灌洗固定，斷頭取視交叉前后2 mm腦組織，中性甲醛固定48 h，經(jīng)石蠟包埋、切片。按試劑盒說明書進行TUNEL染色，胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒為TUNEL陽性細胞。再采用SP法檢測Caspase-3的表達，具體操作均按試劑盒說明書進行，胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒為陽性細胞。兩種染色每張切片觀察10個高倍鏡視野(×400)，計算平均每張切片的陽性細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 Sham組神經(jīng)行為學(xué)評分為0分；與I/R組比較，Lpost組神經(jīng)功能缺損較輕(P<0.05)，見表 1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積及 Caspase-3陽性細胞數(shù)比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與Lpost組比較：2)P<0.05

2.2 腦梗死體積測定 TTC 染色后，缺血梗死區(qū)腦組織呈白色，主要分布在矢狀裂至外側(cè)裂下2/3的皮質(zhì)以及視交叉前后3 mm之間；矢狀裂至外側(cè)裂上1/3的皮質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)白色向紅色的過渡，為缺血半暗帶的區(qū)域；正常腦組織被染成紅色。與Lpost組比較，I/R組腦梗死體積較大(P<0.05)，見表 1。

2.3 各組大鼠神經(jīng)元凋亡的比較 Sham組可見少量的凋亡細胞；與I/R組凋亡細胞數(shù)(27.83±2.93)%相比，Lpost組凋亡細胞數(shù)明顯減少〔(17.67±2.16)%,P<0.05〕，見圖1。

2.4 Caspase-3陽性細胞數(shù)比較 Caspase-3主要分布于神經(jīng)元，鏡下見胞質(zhì)、胞核棕黃色著色為陽性，見圖2。Sham組僅有少量Caspase-3陽性表達；與I/R組比較，Lpost組 Caspase-3陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠缺血區(qū)腦組織TUNEL陽性細胞(×400)

圖2 各組大鼠缺血區(qū)腦組織 Caspase-3的表達(DAB，×400)

3 討 論

研究表明〔4〕，缺血中心區(qū)神經(jīng)元的壞死和缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡是缺血性腦卒中后神經(jīng)元的死亡主要表現(xiàn)形式。然而，缺血半暗帶的腦組織損傷具有可逆性，如何有效干預(yù)缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡已然成為研究的熱點。本研究結(jié)果證實，肢體缺血后處理減少大鼠腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量，且下調(diào)相應(yīng)區(qū)域 Caspase-3 的表達，從而發(fā)揮缺血再灌注后腦保護的作用。

Lpost對缺血腦組織具有保護作用，但是其保護機制尚不明確。Sun等〔5〕在大鼠腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，肢體缺血后處理可通過神經(jīng)途徑發(fā)揮腦保護作用。本實驗結(jié)果表明，Lpost 減輕腦缺血損傷可能是通過協(xié)同缺血誘導(dǎo)的細胞凋亡機制介導(dǎo)的。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)作為細胞凋亡過程的重要蛋白酶在凋亡的最后實施過程中起決定性的作用，而 Caspase-3 作為多種凋亡程序啟動的執(zhí)行者，有著非常重要的意義和作用〔6〕。以往研究證實〔7〕，抑制 Caspase-3 的活性對缺血性腦損傷具有較明顯的神經(jīng)保護作用。Caspase-3作為 Caspases 家族重要的成員，在細胞內(nèi)以前體的形式存在。研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，激活細胞凋亡途徑可以介導(dǎo) Caspase-3 前體表達及活化水平的上調(diào)。本研究結(jié)果提示，Lpost 可以介導(dǎo)局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū) Caspase-3 表達的下調(diào)，減小腦組織梗死的體積，減輕神經(jīng)功能缺損評分，抑制神經(jīng)元發(fā)生進行性損傷，從而對腦缺血后神經(jīng)細胞起到保護作用。

綜上，肢體缺血后處理可以減輕局灶性腦缺血再灌注缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡，具有神經(jīng)保護的作用，有利于缺血半暗帶的轉(zhuǎn)歸，其機制可能與下調(diào)缺血半暗帶 Caspase-3 的表達有關(guān)。

1 韓 冬，白 洋，馬 爽，等.缺血后處理對大鼠缺血再灌注后星形膠質(zhì)細胞的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(8)：1854-5.

2 王耀輝，李國輝，馮華坤，等.線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的體會與評價〔J〕.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2013；16(10)：1686-8.

3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

4 張紅明，曾子玲，李曉燕.線粒體依賴的凋亡通路與缺血性腦卒中〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2013；15(7)：778-80.

5 Sun XC，Li WB，Li QJ，etal.Limb ischemic preconditioning induces brain ischemic tolerance via p38 MAPK〔J〕.Brain Res，2006；1084(1)：165-74.

6 Dejonckheere E，Vandenbroucke R，Libert C.Matrix metalloproteinases as drug targets in ischemia/reperfusion injury〔J〕.Drug Discovery Today，2011；16(17)：762-78.

7 高維娟，張 霞，劉莎莎.大鼠腦缺血再灌注后海馬 CA1 區(qū) Caspase-3 的表達及細胞凋亡的動態(tài)變化〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(24)：6202-4.

8 莊 嚴，王丹丹，柳忠蘭，等.吸煙對大鼠局灶性腦缺血后Caspase-3表達及細胞凋亡的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(1)：156-8.

〔2015-10-10修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢園)

廣西省自然科學(xué)基金(2012jjAA40148)；桂林市科技開發(fā)項目(0110119-1-6)

韋家俊(1976-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管疾病研究。

R743

A

1005-9202(2017)04-0804-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.009