牟漢川 楊志寬 暴亞鋒 王玉玲 劉 靜 張繼虹

(昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院衰老與腫瘤分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

他汀藥物對(duì)p53突變腫瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制

牟漢川 楊志寬 暴亞鋒 王玉玲 劉 靜 張繼虹

(昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院衰老與腫瘤分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

目的 研究他汀藥物對(duì)p53突變的腫瘤細(xì)胞的作用及分子機(jī)制。方法 采用具有突變p53背景的人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)他汀藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響，用Western印跡檢測(cè)他汀藥物濃度梯度和時(shí)間梯度處理后細(xì)胞內(nèi)突變p53，分子伴侶熱休克蛋白(HSP)90、p53信號(hào)通路下游靶蛋白PUMA、p21、凋亡相關(guān)蛋白PARP的表達(dá)情況。結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，他汀藥物會(huì)顯著抑制HT29細(xì)胞的增殖，美伐他汀IC50為(39.95±3.81)μmol/L，辛伐他汀IC50為(24.99±0.70)μmol/L。Western印跡結(jié)果顯示，隨著濃度和時(shí)間梯度增加，突變p53和HSP90表達(dá)水平?jīng)]有改變，但是，p53下游靶蛋白PUMA、p21的表達(dá)水平升高，PARP蛋白切割增強(qiáng)。結(jié)論 他汀藥物能夠抑制p53突變的腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是將突變型p53恢復(fù)為野生型p53從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因的功能。

他??；突變p53；凋亡

野生型p53是一個(gè)腫瘤抑制因子，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。突變或功能缺失的p53會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)，基因組不穩(wěn)定，對(duì)應(yīng)激信號(hào)產(chǎn)生抗性，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中p53的突變率約為50%〔2〕。突變p53失去了野生型p53對(duì)細(xì)胞應(yīng)激的保護(hù)作用。大多數(shù)的p53突變都是發(fā)生在DNA結(jié)合區(qū)的錯(cuò)義突變，這直接導(dǎo)致DNA不能正確與之結(jié)合并破壞其轉(zhuǎn)錄活性。突變p53使得腫瘤細(xì)胞獲得對(duì)化療的耐藥性，增強(qiáng)細(xì)胞生長、代謝和侵入等致癌的新功能〔2〕。正常細(xì)胞中野生型p53主要通過MDM2的泛素化途徑降解。同樣，在腫瘤細(xì)胞中突變p53由于細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)而積累。因此，野生型p53在細(xì)胞中積累而抑制腫瘤，突變p53積累使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生獲得性功能而促腫瘤發(fā)生。以突變p53為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的研究中，一方面是使突變p53部分或全部恢復(fù)野生型p53功能，并激活其下游蛋白PUMA、p21、NOXA等的表達(dá)，從而發(fā)揮與野生型p53相似的抗腫瘤活性〔3，4〕。他汀藥物作為一種3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，可降低膽固醇和抑制類異戊二烯的合成，不僅用于治療心血管疾病，還可以用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和腫瘤〔5〕。然而，其具體的抗腫瘤作用機(jī)制仍不清楚。本研究初步探討他汀藥物中的美伐他汀和辛伐他汀在具有突變p53背景的人結(jié)腸癌HT29(R273H)細(xì)胞中的抗腫瘤作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；美伐他汀(mevastatin)和辛伐他汀(simvastatin)購自Sigma公司；胎牛血清、1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；MTT購自Sigma公司；DMSO(溶解藥物)購自Amresco公司；DMSO(溶解甲瓚)購自Coolaber公司；熱休克蛋白(HSP)90、p53抗體購自Santa公司；PARP抗體購自CST公司；PUMA抗體購自Abcam公司；p21抗體購自BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照一定的細(xì)胞密度接種到96孔板中(不同的細(xì)胞設(shè)置不同的接種密度)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；一種他汀藥物設(shè)置5個(gè)濃度梯度(0.1、1、10、50、100 μmol/L)3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)；每孔加入5 mg/ml的MTT溶液25 μl，放置于培養(yǎng)箱中4 h；吸棄懸液加入150 μl DMSO，置搖床上振蕩10 min；于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長下測(cè)定OD值。根據(jù)測(cè)定的OD值計(jì)算出IC50值和細(xì)胞的相對(duì)存活率。

1.2.3 Western印跡實(shí)驗(yàn) 藥物處理后的細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下并收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，用1×PBS清洗1次，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃過夜，用1×TBST清洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫2 h。用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 美伐他汀和辛伐他汀對(duì)細(xì)胞增殖的影響 辛伐他汀IC50為(24.99±0.70)μmol/L，美伐他汀IC50為(39.95±3.81)μmol/L。從細(xì)胞存活率曲線圖中可以直觀地看出隨著藥物濃度的增加，HT29細(xì)胞的存活率逐漸降低(圖1)。提示他汀藥物可抑制具有突變p53背景細(xì)胞的增殖。

圖1 他汀藥物對(duì)HT29細(xì)胞存活率的影響

2.2 美伐他汀和辛伐他汀對(duì)p53下游蛋白表達(dá)的影響 美伐他汀和辛伐他汀處理HT29后隨著濃度的增加細(xì)胞中突變p53蛋白表達(dá)水平并沒有明顯改變。同時(shí)，可與突變p53形成穩(wěn)定復(fù)合體的HSP90蛋白表達(dá)水平也沒有改變(圖2)。但是，p53下游靶蛋白PUMA和p21隨著濃度梯度的增加表達(dá)水平上升(圖3)。提示他汀藥物可能是通過恢復(fù)野生型p53的活性，進(jìn)而激活p53下游凋亡相關(guān)的PUMA和細(xì)胞周期相關(guān)的p21的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖2 他汀藥物對(duì)HT29細(xì)胞突變p53和HSP90表達(dá)的影響

圖3 他汀藥物對(duì)HT29細(xì)胞p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白 PUMA和p21表達(dá)的影響

2.3 美伐他汀和辛伐他汀對(duì)PARP蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置濃度梯度和時(shí)間梯度處理HT29細(xì)胞后進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，隨著濃度和時(shí)間梯度的增加，美伐他汀和辛伐他汀均能誘導(dǎo)PARP蛋白的切割(圖4)。提示他汀藥物可促進(jìn)具有突變p53背景的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖4 他汀藥物對(duì)HT29細(xì)胞PARP蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

不同的胞內(nèi)應(yīng)激信號(hào)會(huì)導(dǎo)致p53信號(hào)通路的激活，使p53參與到翻譯的調(diào)節(jié)中并發(fā)揮其腫瘤抑制功能〔6〕。在大多數(shù)人類腫瘤中的一個(gè)共同特征是p53發(fā)生突變或p53信號(hào)通路紊亂而導(dǎo)致p53功能缺失。75%的突變導(dǎo)致表達(dá)的p53蛋白失去其野生型的功能并對(duì)殘存的野生型p53存在負(fù)顯性調(diào)節(jié)〔7〕。并且，突變p53獲得原癌基因功能對(duì)野生型p53并不依賴〔8〕。已經(jīng)有研究表明，50%的人類癌癥中都會(huì)發(fā)生p53突變〔9〕。因此，通過作用于突變p53(降解突變p53或恢復(fù)為野生型p53)進(jìn)行抗腫瘤研究具有非常好的前景。

他汀類作為一種治療心血管疾病的藥物，同樣也可用于抗腫瘤的治療中。Murtola等〔10〕對(duì)24 723例前列腺癌治療病例分析后發(fā)現(xiàn)，患者使用阿托伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀后可明顯降低高級(jí)前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Lakha等〔11〕分析603例結(jié)腸癌患者，其中309例使用他汀，294例不使用他汀，發(fā)現(xiàn)他汀可明顯延長病人的生存期，還可降低向高級(jí)轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。在其他高發(fā)性癌癥中，對(duì)肺癌的治療效果很差，對(duì)乳腺癌的治療效果取得不錯(cuò)的進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，美伐他汀和辛伐他汀對(duì)突變p53和HSP90的表達(dá)并無明顯影響，但是p53下游的靶蛋白PUMA、p21表達(dá)上調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白PARP也發(fā)生切割。PUMA、p21是p53信號(hào)通路下游的靶蛋白，可以參與到凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控。PARP是存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的一個(gè)多功能蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，也是細(xì)胞凋亡核心成員caspase的切割底物，因此它在DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。從蛋白水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，他汀藥物處理HT29細(xì)胞后可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的發(fā)生。提示他汀藥物可能通過恢復(fù)p53的部分或全部功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，他汀藥物可通過作用于突變p53發(fā)揮其抗癌功能。Di Agostino等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，他汀藥物可破壞突變p53/YAP/NF-Y在細(xì)胞核中形成的復(fù)合體，使YAP釋放到細(xì)胞質(zhì)中，減少Cyclin A、Cyclin B和CDK1的蛋白表達(dá)水平，抑制含突變p53腫瘤細(xì)胞的生長。Parrales等〔13〕通過高通量篩選證實(shí)他汀藥物可特異性抑制表達(dá)突變p53的腫瘤細(xì)胞的生長，他汀通過抑制甲羥戊酸-5-焦磷

酸的合成，削弱突變p53和HSP40的相互作用，誘導(dǎo)突變p53通過CHIP介導(dǎo)的泛素化途徑降解而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)采用p53突變的HT29細(xì)胞初步觀察到美伐他汀和辛伐他汀可抑制細(xì)胞的增殖。在此基礎(chǔ)上，采用不同濃度的藥物處理，發(fā)現(xiàn)p53下游相關(guān)蛋白PUMA、p21的表達(dá)增強(qiáng)，凋亡相關(guān)蛋白PARP發(fā)生切割。提示他汀藥物抑制HT29細(xì)胞增殖的作用機(jī)制是通過恢復(fù)p53對(duì)下游蛋白的調(diào)控功能進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤活性。

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〔2016-11-28修回〕

(編輯 曲 莉)

The effect and mechanism of statins on p53 mutant tumor cells

MOU Han-Chuan,YANG Zhi-Kuan,BAO Ya-Feng,etal.

Lab of Molecular Genetics of Aging and Tumor,Faculty of Medicine,Kunming University of Science and Technology,Kunming,650500,Yunnan,China

Objective To explore the effect of statins on p53 mutant tumor cells and the underlying molecular mechanism.Methods The human mutant p53 colon cancer cells HT29(p53 mutant)were in vitro cultured. Cell proliferation was tested by MTT method. The expression of molecular chaperones HSP90,p53 target genes PUMA and p21,apoptosis-related protein PARP were measured by Western blot.Results Statins significantly inhibited the proliferation of HT29 cells,treatment with mevastatin exhibited an IC50 value of (39.95±3.81)μmol/L,the simvastatin exhibited an IC50 value of (24.99±0.70) μmol/L.Compared with those of control group,the protein expressions of mutant p53 and HSP90 were not affected,but statins significantly upregulated the protein expressions of PUMA,p21,and PARP.Conclusions Statins could inhibit the growth of HT29 cells,upregulation of p53 target genes PUMA and p21,but had no effect on the expression of mutant p53,demonstrates that it is possible to restore p53 responses in p53 mutant cells.

Statin;Mutant p53;Apoptosis

國家自然科學(xué)基金(81560601)；云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014FD011)

張繼虹(1972-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子藥理學(xué)及抗腫瘤藥物機(jī)制研究。 劉 靜(1987-)，女，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤藥理學(xué)和靶向抗腫瘤藥物機(jī)制研究。

牟漢川(1992-)，男，碩士，主要從事腫瘤藥理學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0788-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.004