陶源 聶國輝 胡洪義 琚良艷 宋為明

噪聲這一常見的環(huán)境污染影響著人們的健康。噪聲性聽覺損傷（noise induced hearing loss，NIHL）是一種典型的強噪聲導致的感音神經(jīng)性耳聾。提前暴露于中等水平的聲刺激一定時間，可以顯著減少其后由于高強度聲刺激引起的永久性閾移[1～3]，此為條件性噪聲保護作用，第一次是由Canlon等[4]提出，以后在多種哺乳動物乃至人類在研究中被涉及。如毛絲鼠［5］，豚鼠［6，7］等。不同的研究目的會選擇不同頻率的噪聲。Canlon［4］等人選擇了1 kHz，Campo等[8]使用0.5 kHz，Subramaniam［9］等人公布了4 kHz的結(jié)果。目前對于條件性噪聲頻率特異性未有肯定的研究。為了研究條件性噪聲保護作用的頻率特異性，筆者觀察不同頻率聲音刺激的條件性噪聲是否具有保護作用。此外，通過耳蝸基底膜鋪片熒光染色進行形態(tài)學觀察，為進一步的分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗使用32只重250～300克的雌性白毛紅目豚鼠。動物實驗協(xié)議由北京大學深圳醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 分組與噪聲暴露

豚鼠被隨機分成8組（每組4只），命名為A、B、C、D、E1、E2、E3和E4組。A～D組分別暴露于4 kHz 85 dB SPL的噪聲10小時（A組），4 kHz 105 dB SPL的噪聲10小時（B組），0.5 kHz 85 dB SPL的噪聲10小時（C組），0.5 kHz 105 dB SPL的噪聲10小時（D組）。另外，為了進行交叉對照，E1～E4組分別給予較低水平的條件性噪聲（85 dB SPL，0.5 kHz或4 kHz，10小時）。它們在實驗過程中被放置在2 m×2 m×2 m的靜音室（＜25 dB A）中。詳細的噪聲暴露過程如表1所示。

表1 各組噪聲暴露過程

每組的4只豚鼠在靜音室中同時暴露于音頻設備（Yamaha MSP7 Studio，印度尼西亞）發(fā)出的噪聲。在實驗過程中豚鼠擁有充足的水和食物。

1.3 聽閾測量

1.3.1 ASSR 使用ASSR測量每組噪聲暴露前后的聽覺閾值。ASSR發(fā)生在連續(xù)多頻聲音刺激聽覺系統(tǒng)時。由于刺激是幅度調(diào)制信號，它可以提供高強度和高超的頻率特征。

1.3.2 聽力監(jiān)聽 用ASSR對所有豚鼠雙耳在任何處理之前(基線閾值)和噪聲暴露后的聽覺閾值進行測評。所有組在最后噪聲暴露20小時后進行ASSR測量以確認臨時閾值變動(temporarg threshold shift，TTS)的恢復。豚鼠用20%的烏拉坦（氨基甲酸乙酯，1.5 g/kg，腹腔注射)進行麻醉，針電極放置在測量耳下面(參考極)，鼻根(地極)和兩個耳朵之間的頭皮(記錄極)。在監(jiān)測過程中，刺激的強度從-10 dB SPL～130 dB SPL，步長5 dB SPL。

1.3.3 統(tǒng)計學分析 采用Origin 9.0用于平均值、標準差和方差等數(shù)值分析。數(shù)據(jù)采用單因子方差分析方法，P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

1.4 耳蝸基底膜鋪片及形態(tài)學觀察

1.4.1 手術過程 豚鼠在烏拉坦腹腔注射麻醉后，斷頭法處死，取出并打開聽泡，蝸尖用尖針鉆孔，鐙骨推入前庭窗，4%多聚甲醛（PFA）灌注，以上步驟在3分鐘內(nèi)完成，4% PFA室溫固定2小時或4℃ 8小時，10% EDTA 4℃過夜脫鈣，0.01 MPBS（PH7.4）內(nèi)浸泡剝離基底膜，按底回，二回，三回，頂回取下基底膜［9，10］。

1.4.2 Hoechst免疫熒光染色 將剝下之標本在培養(yǎng)皿中加入4%PFA，常溫下再次固定2小時，取固定處理好豚鼠耳蝸基底膜放于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，用PH7.4生理濃度PBS緩沖液清洗（5 min×3次，搖床40轉(zhuǎn)速緩搖）。吸出PBS后，使用Hoechst（Hoechst 33342，Life Technologies，USA）進行染色。取Hoechst：PBS=1：2000（20 ml配10 μg）稀釋染核3min，吸出，用PH 7.4生理濃度PBS清洗3次，每次5 min。取出耳蝸基底膜組織放置于載玻片上，滴加25 ul封片劑，分清正反后將螺旋器這面朝上用蓋玻片封片，注意不要有氣泡，在組織濕潤的條件下封片。最后使用萊卡熒光顯微鏡（Leica DM400B/DFC480），藍光激發(fā)340～380 nm下觀察。

2 結(jié)果

2.1 不同噪聲暴露下整體聽力損傷

對比噪聲暴露前后的平均聽覺閾值變化見圖1，表2。

實驗動物整體聽閾提高大約25.5 dB SPL，左耳26.9 dB SPL，右耳24.1 dB SPL，每組前后對比方差分析(P＜0.05）。

2.2 聽覺損傷與保護作用的頻率特異性

2.2.1 單次噪聲暴露 A～D組，單次噪聲暴露的各頻率聽閾變化，見圖2。

表3中對比A、B兩組，除1 kHz頻率外，對于0.5 kHz、2 kHz和4 kHz，B組造成的聽閾變化明顯高于A組（0.5 kHz，P=0.000＜0.05；1 kHz，P=0.049＜0.05；2 kHz，P=0.003＜0.05；4 kHz，P=0.000＜0.05；整體，P=0.000＜0.05）。4 kHz噪聲對所有頻率都造成了更大的聽閾位移，尤其在105 dB SPL時。B組如圖2所示，4 kHz的聽閾頻率產(chǎn)生了59.3 dB SPL的位移（左耳52.5dB SPL，右耳66 dB SPL）。

對比C、D兩組，通過方差分析，兩組造成的聽閾變化并不明顯（0.5 kHz，P=0.280；1 kHz，P=0.600；2 kHz，P=0.180；4 kHz，P=0.340；整體，P=0.060）。

2.2.2 條件性噪聲的噪聲暴露 如圖3所示，E1和B組兩組整體平均聽閾變化差異有統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.05。

表4中E1與E2組兩者聽閾差別無明顯統(tǒng)計學意義（P=0.050）。對于0.5 kHz、1 kHz，P值分別為0.080、0.150，均不具備統(tǒng)計學意義。然而，對于2 kHz、4kHz，E2、E1的聽閾變化有統(tǒng)計學意義（P=0.000＜0.05）

D組和E2組兩者聽閾變化不具統(tǒng)計學意義，P=0.590。

D組和E4組的聽閾變化對比無統(tǒng)計學意義（D組14.3 dB SPL，E4組12.5 dB SPL，P=0.160＞0.05）。

E3組和D組，D組閾值變化大約為14.3 dB SPL（左耳15.4 dB，右耳13.2 dB SPL），E3組達到34.2 dB SPL（左耳38.9 dB SPL，右耳29.5 dB SPL），差異具有統(tǒng)計意義（P=0.000＜0.05）。

對比A組與B組，4 kHz 105 dB SPL造成的聽閾變化明顯大于85 dB SPL（A組18.4 dB，B組42.5 dB，P=0.000＜0.05）。對比C組和D組，0.5 kHz 105 dB SPL噪聲比85 dB導致更多的移位，對于所有頻率約3.1分貝。然而，105 dB SPL和85 dB SPL 0.5 kHz的噪音對于2 kHz和4 kHz頻率聽閾的影響并未表現(xiàn)出顯著不同，見表5。

2.3 耳蝸基底膜鋪片染色

耳蝸基底膜鋪片染色處理結(jié)果可分為三種類型：基本正常、部分受損和嚴重損壞，見圖4。

基本正常的耳蝸內(nèi)、外毛細胞結(jié)構排列整齊，見于各組豚鼠接受刺激前。部分受損的耳蝸內(nèi)、外毛細胞排列不規(guī)則，核腫脹（黑色箭頭），部分細胞損失（白色箭頭），見于C、E4組。嚴重受損的耳蝸出現(xiàn)核腫脹（黑色箭頭）和核溶解（紅色箭頭），以及部分細胞損失（白色箭頭），見于B組。

圖1 給予特定噪聲dB SPL暴露處理前后平均聽閾變化（±SD）

圖2 A～D組噪聲暴露后的聽閾變化（±SD dB SPL），左耳右耳分別進行展示

表2 給予特定噪聲暴露處理前后平均聽閾變化（x± SD）（，dB SPL）

3 討論

ASSR相較于同樣具有頻率特性的頻率特異性ABR(tone burst auditory brainstem response，tbABR)來說，具有客觀檢查，客觀判斷的特點，減少了人為干預的誤差，在低頻區(qū)域的測試更有著明顯優(yōu)勢，臨床應用相對成熟，因此被用于本次研究中對豚鼠的聽閾進行客觀測量［11］。Subramaniam［12］研究了在噪聲習服中，低水平的聲音與低頻刺激不能掩蔽高頻噪音。但基于Canlon等人和Campo等人的結(jié)論，Subramaniam認為低頻噪聲可能刺激了耳蝸的更大范圍的耳蝸，所以擁有更大的保護作用［4，8，13］。

表3 A～D組每個頻率的聽閾變化（±SD.dB SPL）

表3 A～D組每個頻率的聽閾變化（±SD.dB SPL）

組別 樣本數(shù)量 0.5 kHz 1 kHz 2 kHz 4 kHz 平均值 (0.5～4 kHz)左耳 右耳 左耳 右耳 左耳 右耳 左耳 右耳 左耳 右耳A 4 17.5±17.4 12.5±9.8 21.8±17.2 23.5±9.0 19.5±10.2 14.5±10.0 20.3±13.5 18.0±14.0 19.8±13.4 17.1±10.6 B 4 39.5±9.7 39.5±9.8 38.0±13.4 32.3±6.8 35.8±10.5 36.5±13.5 52.5±12.4 66.0±20.8 41.4±12.4 43.6±18.4 C 4 8.5±5.3 15.5±4.2 19.5±8.3 11.3±1.7 8.8±9.0 7.8±5.7 11.8±5.3 6.5±6.8 12.1±7.9 10.3±5.7 D 4 13.3±5.7 16.5±1.3 20.8±9.3 14.3±7.4 14.5±7.7 11.8±6.2 13.3±5.1 10.3±2.5 15.4±7.1 13.2±5.1

表4 E1～E4組每個頻率的平均聽閾變化（±SD.dB SPL）

表4 E1～E4組每個頻率的平均聽閾變化（±SD.dB SPL）

組別 樣本數(shù)量 0.5 kHz 1 kHz 2 kHz 4 kHz 平均值 (0.5～4 kHz)左耳 右耳 左耳 右耳 左耳 右耳 左耳 右耳 左耳 右耳B 4 39.5±9.7 39.5±9.8 38.0±13.4 32.3±6.8 35.8±10.5 36.5±13.5 52.5±12.4 66.0±20.8 41.4±12.4 43.6±18.4 E1 4 37.8±7.0 37.0±13.0 33.0±9.6 33.5±12.1 27.0±5.9 19.0±3.2 32.0±5.6 29.3±9.3 32.4±7.5 29.7±11.4 E2 4 27.8±14.4 24.0±15.9 23.5±13.9 25.3±14.5 48.0±18.6 40.3±27.5 64.5±16.1 65.5±12.3 40.9±22.1 38.8±23.9 D 4 13.3±5.7 16.5±1.3 20.8±9.3 14.3±7.4 14.5±7.7 11.8±6.2 13.3±5.1 10.3±2.5 15.4±7.1 13.2±5.1 E3 4 32.3±17.3 30.8±30.5 40.8±25.1 26.5±14.9 40.5±19.3 25.5±14.8 42.0±31.3 35.3±23.3 38.9±21.7 29.5±20.0 E4 4 13.0±2.2 15.0±5.0 20.5±5.3 11.5±3.1 12.8 ± 3.0 10.0±5.6 10.5±11.1 6.5±6.6 14.2±6.9 10.8±5.6

圖3 B組、E1組和E2組的聽閾變化（±SD，dB SPL）比較（a），D組、E3組和E4組的聽閾變化（±SD，dB SPL）比較（b）

圖4 耳蝸基底膜鋪片染色處理結(jié)果：基本正常（a），部分受損（b），嚴重損壞（c）

一般動物聽力曲線的敏感范圍從0.5～16 kHz，而鼠則從6.3～24 kHz。為了驗證噪聲習服的頻率特異性，F(xiàn)owler［14］等人使用了小鼠聽力圖。盡管如此，結(jié)果并沒有顯示有任何的保護作用，小鼠的聽覺系統(tǒng)一度被認為對于噪聲習服有特殊的反應。所以目前對于條件性噪聲頻率特異性未有肯定的研究，對于各種頻率的交叉保護作用亦不明確。

E1組和B組平均閾移之間的差異是明顯的，尤其是在高頻率（2 kHz 13.1 dB SPL，4 kHz 28.6 dB SPL，P=0.000＜0.05），這證明了條件性噪聲的保護作用是存在的。Masoud Motalebi Kashani［15］發(fā)現(xiàn)不同頻率預處理聲音的頻差不影響ABR閾移，這不同于本實驗結(jié)果。由于不同聲刺激方法的使用，4 kHz噪音表現(xiàn)出良好的同頻率和交叉頻率保護作用，E1和E2在4 kHz的聽閾差異充分揭示了4 kHz條件噪聲的頻率特異性。此外，0.5 kHz預處理噪聲降低了隨后的4 kHz的噪聲暴露低頻率的閾值偏移（0.5 kHz 13.6 dB SPL，4 kHz 10.8 dB SPL，P=0.006＜0.05）。因此，低頻率聲音可能會為進一步的噪聲暴露提供保護，特別是對低頻范圍內(nèi)的噪音，但是0.5 kHz的條件性噪聲對于4 kHz的保護性不明顯。而且，0.5 kHz中等水平聲音對后續(xù)0.5 kHz高強度噪聲的高頻區(qū)域幾乎不能起到保護作用（D組，E4組）。D組E3組，4 kHz的聲音提高了所有頻率的閾值變化，沒有任何保護作用，這與之前skellett［16］的報道一致。

此前的研究表明，強烈的噪音刺激會導致細胞壞死和細胞凋亡同時發(fā)生。Hoechst是一種具有核酸的特異性染料，用來區(qū)分壞死與凋亡。染色質(zhì)濃縮和核碎裂發(fā)生在凋亡細胞中，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)為核密集染色或碎片密集染色。然而，壞死細胞通常為核腫脹的熒光褪色。熒光染色描繪了三個病理變化：核腫脹、核溶解和部分細胞丟失。如圖4所示，外毛細胞比內(nèi)毛細胞有更多的損傷。此外，外毛細胞的損傷主要集中在耳蝸底轉(zhuǎn)和二轉(zhuǎn)，與之前Hu［17］的研究相符。損壞的細胞往往從底轉(zhuǎn)到頂轉(zhuǎn)越來越少。由于底轉(zhuǎn)和二轉(zhuǎn)更接近鼓膜，它更有可能受到噪聲影響。

表5 每組每個頻率的平均聽閾（±SD，dB SPL）

表5 每組每個頻率的平均聽閾（±SD，dB SPL）

組別 樣本數(shù)量 0.5 kHz 1 kHz 2 kHz 4 kHz 平均值 (0.5～4 kHz)A 4 15.0±13.4 22.6±12.7 17.0±9.8 19.1±12.8 18.4±12.0 B 4 39.5±9.1 35.1±10.3 36.1±11.2 59.3±17.4 42.5±15.5 C 4 12.0±5.8 15.4±7.1 8.3±7.0 9.1±6.3 11.2±6.8 D 4 14.9±4.2 17.5±8.5 13.1±6.6 11.8±4.0 14.3±6.2 E1 4 37.4±9.7 33.3±10.1 23.0±6.1 30.6±7.3 31.1±9.6 E2 4 25.9±14.2 24.4±13.2 44.1±22.1 65.0±13.2 39.8±22.7 E3 4 31.5±23.0 33.6±20.6 33.0±17.9 38.6±25.8 34.2±21.1 E4 4 14.0±3.7 16.0±6.3 11.4±4.4 8.5±8.7 12.5±6.5

4 結(jié)論

本次研究初步證明了不同頻率條件性噪聲保護作用的頻率特異性。不同頻率的條件性噪聲對于不同類型的噪聲損害的保護作用是有明顯差異的，這對于研究不同噪聲損害保護中是否應該使用不同的頻率類型提供了依據(jù)，此外，更多頻率的組別、基底膜上不同的部位的損害情況及形態(tài)學依據(jù)也將加入后續(xù)研究。

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