王雷，陳傳波，馬明德

（河南大學附屬淮河醫(yī)院 乳腺外科，河南 開封 475001）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居于女性惡性腫瘤首位，具有較高的復發(fā)率和病死率[1]。因此，尋找能夠抑制乳腺癌細胞侵襲遷移的的分子靶點對改善患者預(yù)后、延長生存期具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一種由17～25個氨基酸組成的短片段非編碼RNA，其能夠通過與靶基因的mRNA結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄翻譯，進而參與細胞增殖、分化等生物學進程，在惡性腫瘤的疾病進展中發(fā)揮重要作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)miR-26b在肝癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)表達異常，研究表明其乳腺癌細胞中呈低表達，但其具體分子機制尚不明確[2-4]。生物信息學分析預(yù)測miR-26b是Foxf2的一種miRNA調(diào)節(jié)因子，以往有研究[5-6]顯示叉頭框轉(zhuǎn)錄因子Foxf2的表達水平升高與乳腺癌、宮頸癌的遷移侵襲具有密切相關(guān)性。因此，本研究通過轉(zhuǎn)染技術(shù)使miR-26b在人乳腺癌細胞MCF-7過表達，旨在探討miR-26b對細胞遷移、侵襲及Foxf2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設(shè)備

1.1.1 細胞系 人乳腺癌細胞系MCF-7細胞株、人乳腺上皮細胞MCF-10A，購自于中國科學院細胞典藏庫。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；miR-26b minic，購自美國Applied biosystems公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、TRIZOL?Reagent Cat購自美國 Invitrogen公司；MTT，購自美國Sigma公司；引物，由上海生工生物工程有限公司合成；miScript Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq熒光定量試劑盒，購自日本Takara公司；Dual-Glo?雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；RIPA蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒，購自北京康為世紀生物技術(shù)有限公司；鼠抗人Foxf2抗體、β-actin抗體，購自美國Abcam公司；兔抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ECL顯色劑，購自上海西唐生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，購自美國Thermo公司；細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板，購自于美國Corning公司；倒置顯微鏡及數(shù)碼采集系統(tǒng)，購自日本Olympus公司；Mastercycler PCR儀、全波長酶標儀，購自德國Eppendorf公司；熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；流式細胞儀，購自于美國BD公司；離心機購自美國Beckman公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，購自北京六一儀器公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將MCF-7、MCF-10A細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，其中含100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，根據(jù)生長情況進行換液或傳代，經(jīng)3次穩(wěn)定傳代后，可取對數(shù)期細胞進行實驗。根據(jù)實驗設(shè)計將MCF-7細胞分為空白對照組、陰性對照組和miR-26b組，其中空白對照組細胞不做任何處理，陰性對照組按照說明書要求轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，miR-26b組轉(zhuǎn)染miR-26b 模擬物；轉(zhuǎn)染完成后通過qRT-PCR法檢測miR-26b mRNA及蛋白表達情況評估轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染24 h后的MCF-7細胞以7 000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72、96 h向每孔中加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基加入150 μL DMSO，水平震蕩10 min后于酶標儀490 nm波長下進行吸光值測定，每孔設(shè)3個重復。

1.2.3 細胞劃痕實驗 將轉(zhuǎn)染24 h后的MCF-7細胞接種于6孔板中進行培養(yǎng)，待細胞融合度在90%以上時，吸棄培養(yǎng)基采用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌3次，使用200 μL槍頭在孔中央對細胞作水平劃線，劃線完成后采用PBS吸取脫落細胞，加入2 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，于劃線后0、48 h采用倒置顯微鏡觀察細胞遷移情況，并進行拍照記錄，通過測定劃痕寬度變化評估m(xù)iR-26b對MCF-7細胞遷移的影響。

1.2.4 Transwell遷移實驗 將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中，先在Transwell小室的膜上室加入100 μL含有1×1640培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠進行包被，再將轉(zhuǎn)染48 h后的MCF-7細胞懸浮于無血清培養(yǎng)基中，以每孔250 μL接種于Transwell小室的膜上室，在培養(yǎng)孔中加入500 μL含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h后吸棄上室培養(yǎng)基，采用無菌棉簽擦拭上室，對下室細胞采用4%多聚甲醛進行固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下對下室細胞數(shù)量進行計數(shù)。

1.2.5 qRT-PCR 采用TRIzol法提取細胞總RNA， 采 用miScript Reverse Transcription Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR法檢測MCF-7、MCF-10A細胞中miR-26b mRNA表達量及轉(zhuǎn)染miR-26b模擬物后的MCF-7細胞中miR-26b和Foxf2 mRNA表達量。采用ABI公司7500熒光定量測定儀進行測定，反應(yīng)程序95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s 擴增 40 個循環(huán)，72 ℃ 10 min，共40個循環(huán)；反應(yīng)體系為：2SYBR Premix 12.5 μL， 上 下 游 引 物 各 1.0 μL（10 mmol/L），cDNA 樣本 2 μL，ddH2O 8.5 μL。最終結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計算miR-26b、Foxf2 mRNA相對表達量，每組重復3次。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列Table 1 The primer sequences

1.2.6 Western blot 采用RIPA法裂解細胞提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，并調(diào)整抑制后，上樣20 μL通過10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離蛋白，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，采用5%的脫脂乳進行室溫封閉1 h，吸棄封閉液，加入預(yù)先按照說明書推薦比例稀釋后的一抗，置于4 ℃孵育過夜，采用TBST洗滌膜3次，每次5 min，加入IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌膜3次，每次5 min，加入ECL顯色劑進行顯色，采用全自動凝膠成像儀采集圖片，并使用Quantity One軟件進行條帶灰度值分析，本研究結(jié)果以目的蛋白Foxf2與內(nèi)參蛋白β-actin條帶的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 通過TargetScan軟件預(yù)測miR-26b的可能靶基因，并分析其相互作用的序列位點，擴增Foxf2基因的3'-UTR，其中包含miR-26b的結(jié)合序列，同時通過重疊PCR法構(gòu)建Foxf2基因3'-UTR中miR-26b結(jié)合區(qū)域的突變位點，構(gòu)建表達海腎熒光素酶的載體，構(gòu)建完成后與miR-26b模擬物或空質(zhì)粒和熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，主要分為Foxf2 3'-UTR與miR-26b或空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染、突變體與miR-26b或空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4組，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，采用雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的比值代表各組報告基因的轉(zhuǎn)錄活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，兩兩比較方差齊次用LSD法，方差非齊次用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-26b在乳腺癌細胞中的表達情況

miR-26b在乳腺癌細胞系MCF-7中的相對表達量為0.47±0.03，在乳腺上皮細胞系MCF-10A中的相對表達量為0.95±0.05，miR-26b在乳腺癌細胞中的表達水平明顯低于正常乳腺上皮細胞（P＜0.05）。

2.2 miR-26b模擬物轉(zhuǎn)染效果評價

與空白對照組和陰性對照組比，miR-26b組miR-26b相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組細胞miR-26b的表達水平比較Figure 1 Comparison of the miR-26b expression levels among groups of cells

2.3 miR-26b對MCF-7細胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染miR-26b模擬物后，MCF-7細胞的增殖率隨著時間延長逐漸降低，且在48、72、96 h活力均明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組細胞增殖情況比較Figure 2 Comparison of the proliferation abilities among groups of cells

2.4 miR-26b對MCF-7細胞遷移的影響

與空白對照組比較和陰性對照組比較，miR-26b組細胞的遷移能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組細胞遷移能力檢測Figure 3 Determination of the migration ability in each group of cells

2.5 miR-26b對MCF-7細胞侵襲的影響

與空白對照組和陰性對照組比較，miR-26b組Transwell小室內(nèi)細胞穿膜數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組細胞侵襲能力檢測（×200）Figure 4 Determination of the invasion ability in each group of cells (×200)

2.6 miR-26b模擬物轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后Foxf2的 mRNA與蛋白表達情況

與空白對照組和陰性對照組比較，miR-26b組Foxf2 mRNA與蛋白表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 各組細胞Foxf2表達檢測 A：mRNA表達；B：蛋白表達Figure 5 Determination of the Foxf2 expression in each group of cells A: The mRNA expressions; B: The protein expressions

2.7 miR-26b對Foxf2基因3’-UTR的調(diào)控

雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-26b能夠明顯抑制MCF-7細胞中Foxf2-3'UTR的熒光素酶活性（P＜0.05），但對Foxf2-3'UTR突變體的熒光素酶無明顯抑制作用（P＞0.05）（圖6）。

圖6 miR-26b對MCF-7細胞中Foxf2基因轉(zhuǎn)錄活性的影響Figure 6 The in fl uence of miR-26b on transcriptional activity of Foxf2 in MCF-7 cells

3 討 論

近年來miRNA參與腫瘤進展成為多數(shù)研究學者關(guān)注的熱點，其能夠與靶基因的3'-UTR結(jié)合，降解靶基因或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等生理過程[7-8]。MiR-26b與miR-26a、miR-1297、miR-4465共同構(gòu)成miR-26家族，其中miR-26b主要存在于2號染色體CTDSP1基因的第4個內(nèi)含子上，最早對miR-26b的研究多集中于脂肪細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞等正常細胞的分化[9-10]。近年來不斷有研究[11-12]顯示miR-26b亦參與惡性腫瘤的增殖分化。目前有關(guān)惡性腫瘤與miR-26家族成員miR-26a的研究較為成熟，但有關(guān)miR-26b的研究相對較少，其發(fā)揮抗腫瘤作用的具體功能及相關(guān)機制尚未闡明。

陳政綱等[13]發(fā)現(xiàn)miR-26b在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達降低，且與腫瘤級別具有密切相關(guān)性，隨著級別的升高表達呈下降趨勢，上調(diào)miR-26b的表達能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞體外增殖、遷移和侵襲；葉勁軍等[14]顯示miR-26b在胃癌細胞系MGC803、MKN-45中均表達下調(diào)，而過表達miR-26b后則會抑制MKN-45細胞增殖，促進正常胃上皮細胞增殖。本研究通過將miR-26b模擬物轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞系MCF-7細胞株使miR-26b過表達，結(jié)果顯示miR-26b過表達會抑制乳腺癌細胞的增殖分化。結(jié)合過往研究推測[15-16]，miR-26b過表達能夠阻斷細胞周期G1/S時相的轉(zhuǎn)化，進而抑制腫瘤細胞增殖。乳腺癌后期的淋巴結(jié)及肝臟、肺部等遠端器官的轉(zhuǎn)移是導致其病死率高的主要原因之一，因此抑制癌細胞遷移、侵襲是控制疾病進展、改善預(yù)后的關(guān)鍵[17]。本研究采用劃痕實驗和Transwell小室實驗對轉(zhuǎn)染miR-26b后的MCF-7細胞的體外遷移、侵襲能力進行檢測，結(jié)果顯示，miR-26b的過表達對MCF-7細胞的遷移侵襲具有顯著抑制作用，提示miR-26b在乳腺癌疾病進展中發(fā)揮重要作用。

Foxf2是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子Fox家族的主要成員，該家族具有高保真DNA編碼區(qū)和組織特異性，在胚胎形成、發(fā)育及細胞生長分化中發(fā)揮重要作用。最近研究證實Fox家族能夠介導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，與腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲進程具有密切相關(guān)性[18-19]。劉麗敏等[20]研究顯示采用siRNA沉默宮頸癌細胞中Foxf2的表達能夠增強癌細胞的增殖能力和遷移能力，促進癌細胞體外轉(zhuǎn)移；朱麟等[21]研究顯示在低氧環(huán)境誘導下，F(xiàn)oxf2在胰腺癌細胞中表達升高，促進細胞間質(zhì)化。目前有關(guān)Foxf2與乳腺癌的研究相對不足，尚存在部分爭議，有研究指出Foxf2的表達缺失能夠促進乳腺上皮細胞間質(zhì)化，進而增強基底樣乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移，另有研究證實Foxf2啟動子區(qū)CpG島甲基化能夠促進乳腺癌細胞的增殖，推測Foxf2可能在乳腺癌發(fā)展中通過不同作用機制發(fā)揮雙重作用[11,13-23]。近年來，有研究[24]表明微小RNA miR-182能夠通過靶向抑制Foxf2的表達抑制乳腺癌細胞的增殖遷移，目前尚無miR-26b對Foxf2基因的影響的相關(guān)報道。本研究通過多過表達miR-26b的MCF-7細胞中Foxf2基因及蛋白表達水平進行測定，結(jié)果顯示miR-26b過表達組，F(xiàn)oxf2的mRNA和蛋白水平均明顯降低，同時通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行驗證，結(jié)果顯示miR-26b能夠靶向調(diào)控Foxf2的轉(zhuǎn)錄，結(jié)合前期miR-26b轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞遷移侵襲能力下降的結(jié)果，初步表明下調(diào)Foxf2表達可能是miR-26b抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲的分子機制之一。

綜上所述，miR-26b具有抑制乳腺癌細胞體外增殖、遷移、侵襲的作用，提高MCF-7細胞miR-26b表達水平可使Foxf2表達下調(diào)，這可能是miR-26b發(fā)揮抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制之一。故miR-26b可能成為后期乳腺癌診斷及分子靶向治療的分子標志物。

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